Питательная среда для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов и ксиланазы Советский патент 1984 года по МПК C12N1/14 C12N9/42 

со о

:

i

Изобретение относится к микробио логической промышленности и касаетс питательных сред для выращивания продуцентов целякшолитических ферме тов и ксиланазы культуры-Tric ioderm lignorum 60-24, содержащая пшеничны отруби, свекловичный жом, солодовые ростки f 1J . Недостатками этой среды явлйются . сложный составj содержащий большой набор минеральных солей и vмкpoэлeМентов, что значительно ее удорожает, а также низкая активность ксила .назы. Наиболее близкой к изобретению я ляется питательная среда для выраади вания продуцента целлюлолитических ферментов и ксиланазы Aspergillus terreus llf 2, где в качестве ист ника углерода используют измельченную пшеничную солому 2%,. в качестве источника углерода, азота, витамино аминокислот - кукурузный экстракт 1,5%, как источник минерального азо та NaNOj 0,3%, а также КН2РО4 0,2% ;MgSO4 7Н,О 0,05%, водопроводная во |да рН 4, 5. I На этой среде ферментативная ак гивность гриба Asp. terreus. 17р характеризуется следующими величинами единица активности (миллилитр культураль1|ой жидкости) j эндоглюканаза 25 экзоцеллобиогидролаза 1,0; целлобиаза 0,5; ксиланаза 73. Недостатками этой среды являются ее многокомпонентность, высокая стоимость и недостаточно высокая ферментативная активность выращивае мых на ней продуцентов. Целью изобретения является повышение активности продуцентов и удешевление среды. Поставленная цель достигается те что питательная среда для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов и ксиланазы, содержащая источники углерода, азота, вита минов, аминокислот., источник мине рального азота - азотнокислый натри а также минеральные соли - однозаме щенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и воду, содержит в ка честве источника углерода, азота, витаминов и аминокислот солодовые |ростки при следующем соотношении ко понентов, мас.%: Азотнокислый натрий0,3.1 Однозамещенный фосфорнокислый калий0,2 Сернокислый магний0,05 Солодовые ростки 1,5-4,0 Вода, млДо 100 Ферментативная активность продуцентов, выращенных на.предлагаемой среде, отличается высокими показаталями и составляет для Aspergillus terreus I7p и Myceliophthora thermophila no эндоглюканазе 40-42 ед/мл, экзоцеллобиогидролазе 1,0-3,8 ед/мп, целлобиазе 1,2-2,7 ед/мл, ксиланаз 95-420 ед/мп. Преимущество предлагаемой среды заключается в том, что в качестве единственного и одновременного источника углерода, витаминов, аминокислот, а также азота среда содержит солодовые ростки в количестве 1,54,0 мас.%. Солодовые ростки являются дешевым отходом пивоваренного производства и могут быть непосредственно без дбполнительной обработки введены в состав питательной среды. Содержание солодовых ростков менее 1,5 мас.% приводит к снижению активности ферментов, а более 4 мас.% приводит к удорожанию среды без достаточного повышения активности всех ферментов. Пример 1, Берут питательную среду следующего состава, мас.%; солодовые ростки 1,5; NaNOg 0,3; КН2РО4 0,2; МдЗО47НгО 0,5; вода водопроводная рН 4,5, и на ней проводят выращивание продуцента Myceliophtora thermophila ИНМИ PA 1-8, который депонирован под BKM-F-2148 Д. Спорами, полученными при вьаращи,вании культуры на перловой крупе в течение 6 сут, засевают/ колбы емкост ю 250 мл, содержащие 50 мл пред лагаемой среды. Вь защивание про- водят на круговой качалке (180 об/мин) в течение 72 ч при 45. Мицелий с твердыни остатками среды отделяют центрифугированием. Центрифугат используют для определения активности ферментов. Активность целлюлолитических ферментов определяют по известной методике Мэндельс и Вебера в модификации, измеряя количество образовавшимися редуцирующих веществ (в перерасчете на глюкозу) при действии целлюлаз на соотвествующие субстраты (Na карбоксиметилцеллюлозу, фильтровальную бумагу, целлобиозу). Редуцирующие вещества определяют колориметрическим методом ШЬмоди-Нельсона при длине волны 660 нм в кювете с толщиной слоя раствора 5 мм« За единицу активности целлюлаз принято такое количество ферментов, под действием которого при условиях опыта образуется 1 мг редуцирующих веществ в перерасчете на глюкозу. Активность ксиланазы определяют по действию фермента на 1%-ный раствор ксилана. Реакционная смесь состоит из 0/72 мл ксилана, 0,25 мл культуральной жидкости соответствующего разведения. Инкубацию проводят в течение 1 ч. Редуцирующие вещества определяют методом Шомоди-Нельсона. Калибровочную кривую (Строят по ксилозе. За единицу активности ксиланазы принимают, такое количество фермента, под действием которого образуется 1 мг ксилозы в условиях опыта.

Ферментативная активность продуцента имеет следующие показатели, ед/мп: эндоглюканаза 38; экзоцеллобиогидролаза 3,8 целлобиаза 2,3; ксиланаза 370.Пример 2. Берут питательную среду следующего состава, мас.%: солодовые ростки 4; NaNOg 0,3; 0,2; 7Н4О 0,05; водопроводная вода рН 4,5, и на ней проводят выращивание штамма Myceliophthora thermophila ИНМИ РА-1-8.

Посев, условия выращивания и определение активности ферментов осуществляют по примеру 1.

Ферментативная активность продуцента за 72 ч роста достигает следующих показателей, ед/мл: эндоглюканаза 42; экзоцеллобиогидролаза 3,9; целлобиаза 2,7; ксиланаза 420.

Пример 3. Берут питательную среду следующего состава, мас.%: солодовые ростки 2,5; NaNOj 0,3; , 0,2; 0,05; водопроводная вода рН 4,5, и на ней проводят выращивание штамма Aspergillus terreus 17 р, депонированного под -F-1862.

Суспензией спор, полученной с№звом с поверхности плотной питательной среды, содержащей (%: NaNO. 0,3;

NHjPq, 0,2; MgS04- 0,05, с полос.кой фильтровальной бумаги в качестве источника углерода, засевают 100 мл предлагаемой среды.Продуцент культивируют в колбах на 250 мл на круговой качалке (220 об/мин) при 40 в течение 96 ч. Активность ферментов определяют в культуральной жидкости после отделения центрифугированием мицелия и твердых остатков согласно примеру 1,.

При культивировании гриба Asp. terreus 17р на предлагаемой среде получены следующие результаты, ед/мя; Эндоглюканаза 40; экзоцеллобиогидролаза 1,0; целлобиаза 1,2; ксиланаза

,96,...

I I Как видно из приведенных результатов, предлагаемая среда обеспечивает

.более активный биосинтез целлюлолитических ферментов и ксиланазы.

Солодовые ростки в качестве источника азота, углерода, витаминов и аминокислот заменяют одновременно два компонента - дорогостоящий кукуруз ный экстракт, получает ый из пищевого сырья, и солому, на размол и усиленный режим стерилизации которой требуется значительный расход энергии

; Солодовые ростки очень богаты углеводами, аминокислотами, азотисты,ми и минеральными веществами, витакйнами, содержат до 12% целлюлозы и

|Ксилан. Целлюлоза и ксилан являются индукторами биосинтеза указанных ферментов. Солодовые ростки являются отходом .пивоваренного производства,

,их стоимость в 2,4 раза ниже куку;рузного экстракта.

Myceliophthora thermophila синтезирует ксиланазу с активностью 370;420 ед/мп, которая значительно превышает активность известной. Наряду с ксиланазой образуется комплекс . целлюлоз с особенно активной эндоглюканазой, накапливается значительная биомасса гриба.

В настоящее время известна питательная среда для культивирования Asp.niger 15 в опытно-промышленном масштабе. Получены партии ферментного препарата. Недостатком этой среды является ее сложный состав и довольно низкая активность ксиланазы (20 ед/мп) при длительном культивировании продуцента (7 сут).

В заводских условиях получена высокоактивная культуральная жидкость гриба Asp.terreus 17р, которая испытывается в сельском хозяйстве при облагораживании грубых кормов для животных . В опытно-промышленных условиях также получены партии ферментного препарата, которые будут переданы для .-дальнейшей очистки во ВНИТИАФ медицинского назначения (г.Ленинград) с целью создания полиферментной лекарственной формы.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И КСИЛАНАЗЫ, содержащая источники углерода, азота, витаминов, аминокислот, источник минерального азота - азотнокислый ... / рий, а также минеральные соли - однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения активности продуцентов и 1 удешевления среды, она дополнительно содержит в качестве источника углерода, азота, витаминов и аминокислот солодовые ростки при следую.щем соотношении компонентов, мас.%: Азотнокислый натрий0,3 Однозамещенный фосфорнокислый каший0,2 Сернокислый i магний0,05 Солодовые ростки1,5-4 (Л Вода, млДо 100