Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/34 C12N1/20 

Изобретение относится к микробио логической отрасли промышленности, в частности к ферментной, а именно приготовлению питательной среды для культивирования продуцентов глюкоами лазы. Известен способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамйлазы, предус матриваюгций приготовление 16-20% суспензии кукурузной муки, разваривание суспензии муки при 49-176°С (давление 5-12 атм )в течение 3035 мин, охлаждение разваренной массы, внесение амилолитических ферментов в виде солода в количестве 1-3% к весу муки, гидролиз муки при 63°С охлаждение гидролизата до 33-37°С, добавление глутаминовой кислоты, стерилизацию среды и охлалсдение ее. Приготовленную таким образом среду засевают продуцентом глюкоамйлазы, в качестве которого используют Aspergillus awamori и культивируют продуцент до максимальной активности глюкоамйлазы в среде (160-290 ч) Недостатками такого способа являются разваривание муки при высоких температурах, что требует наличия специальной аппаратуры и расходование значительного количества электроэнергии, применение солода, для приготовления которого используется высококондиционное зерно, получаемая среда вязкая, что затрудняет процесс аэрации среды, в связи с чем увеличи ваетсяпродолжительность процесса культивирования. Наиболее близкш к предлагаемому по технической сущности и достигае.мому положительному эффекту является способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамйлазы, предусматривающий приготовление суспензии муки, введение в суспензию амилолитических и целлюлолитических ферментов, гидролиз суспензии, добавление в гидролизат источников азота и минеральных солей с последующей стерилизацией среды. При этом суспензию муки разваривают при 127 138°С (1,52,5 атм )в течение 1,5-2 ч, амилолитические ферменты вводят постадийно, сначала в количестве 0,2-0,5 ед муки в суспензию муки, охлажденной : до 95-90°С и затем после снижения температуры до 85-80 С в количестве 0,8-0,5 ед/г одновременно с крахмалом, а препараты.пектиназы (Пк| или целхшлазы вводят после 10-минутного гидролиза амилазами (А ), внесения остальных компонентов среды, доведением рН до 4,5 в количестве 0,5 ед ПкА или .1 ед суспензии на 1 г сухих взвешенных веществ среды. Гидролиз осуществляют в течение 1 ч, доводят рН до 6,0 и стерилизуют среду С23. Недостатком известного способа является разваривание суспензии муки, что требует больших энергозатрат и мнократный гидролиз крахмалсодержащего сырья, что значительно усложняет процесс приготовления среды. Целью изобретения является ускорение и упрощение процесса приготовления питательной среды. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамйлазы, предусматривающему приготовление суспензии муки, введение в суспензию амилолитических и целлюлолитических ферментов, гидролиз суспензии, добавления в гидролизат источников азота и минеральных солей с последующей стерилизацией среды, в суспензию муки дополнительно вводят пшеничные отруби, а также пектолитические ферменты, причем содержание муки и отрубей в суспензии соответственно 10-1А и 4-8 мас.%, а ферменты вносят в суспензию в следующих количествах, ед/г смеси муки и отрубей:Амилолитические ферменты1,5-10 Целлюлолитические ферменты0,1-1 Пектолитические ферменты0,1-1 В суспензию муки также дополнительно вносят протеолитические ферменты в количестве 0,1-1 ед/г смеси муки и отрубей. С целью использования среды для непрерьшных процессов культивирования продуцентов глюкоамйлазы из полученного гидролизата суспензии муки и отрубей выделяют жидкую фракцию, в которую дополнительно вводят гидролизат крахмала, а источники азота и минеральные соли вводят в смесь гидролизатов крахмала и суспензии муки и отрубей. Способ осуществляют следующим образом. Готовят суспензию, содержащую 1014 мас.% муки и 4-8 мас.% пшеничных отрубей, рН суспензии устанавливают равнь1М 4,5-6,3, полученную суспензию нагревают до 40-60°С и вносят амилолитические, пектолитические и целлюлолитические ферменты в количествах соответственно равных 1,5-10 и по 0,1-1 ед/г смеси муки и отрубей, суспензию вьщерживают при 45-90 С в течение 0,5-2,0 ч. При использовании среды для периодического культивирования продуцентов глюкоамилазы ,в полученный гидролизат вносят источники азота,в качестве которого могут быть использованы дрожжи, автолизат дрожжей, с лодовые ростки, вытяжка солодовых ростков, кукурузный экстракт, соли аммония, азотнокислые соли и источНИКИ фосфора - фосфорнокислые соли. Приготовленную таким образом среду стерилизуют 40-60 мин при 12lc. При использовании среды для непрерывных процессов культивирования продуцентов глюкоамилазы из полученного гидролизата мукн и отрубей вьщеляют жидкую фракцию фильтрованием или центрифугированием, В жидкую фракцию гидролизата вносят гидролизат крахмала, источники азота и фосфорнокислые соли. Полученную сре ду стерилизуют и охлаждают. Ферменты можно вносить одновременно, при этом гидролиз проводят в две стадии первую - при рН 5,5-6,3, температуре 45-55°С в течение 10-60 мин, а вторую - при 70-90 с в течение 2060 мин или первую стадию - при рН 4, 5,0(Температуре 45-55°С в течение 20-60 мин, а вторую - при рН 5,86,3, температуре 70-90 С в течение 10-40 мин. Указанные ферменты можно вносить последовательно, В приготовленную суспензию муки и отрубей с рН 4,5-5,0 можно вначал внести петолитические и целлюлолитические ферменты в количестве 0,11,0 ед на I г смеси муки и отрубей, гидролиз осуществить при 45-55 0 в течение 30-60 мин, затем рН изменить до 5,8-6,3 доба.влением аммиака внести амилолитические и протеолити ческие ферменты в количествах соотетственно равных 1,5-10 ед и 0,11 ед на 1 г смеси муки и отрубей и успензию прогидролизовать при 700°С в течение 10-60 мин. Пример 1. В ферментер Биолаит Б-50 наливают 5 л воды, включат мешалку и, подогрев до 40С,вноят 1,8 кг муки, затем наливают еще 5 л воды и вносят 0,6 кг пшеничных трубей, объем суспензии доводят до 14,4 суспензии устанавливают 5,0 и вносят 0,8 г амилосубтилина Г 10х, 0,48 г целловиридинаТЗх и 8,9 г пектофостидина ГЗх, раствоенные в воде (0,6 л/, температуру суспензии поднимают до 50 С и выерживают 30 мин, затем температуру поднимают до 85с, выдерживают 10 мин. Полученный гидролизат при окрашивании иодом не изменяет окраски. Затем в гидролизат вносят вытяжку солодовых ростков 0,75 л(Шц.)2504 15 г, MgSO. 7,5 и. Приг. готовленную таким образом среду стерилизуют прд 121 С в течение 40 мин, охлаждают, засевают продуцентом глюкоамилазы Aspergillus awamori и культивируют при 33°С в течение 120 ч при аэрации и перемешиваний. В процессе культивирования отбирают пробы. Активность глюкоамилазы в глубинной культуре через 96 и 120 ч культивирования соответственно равной 1б8 и 118 ед/мл (по глюкозооксидазному методу ). В контрольном опыте при культивировании этого же штамма на среде, приготовленной по известному способу 2 активность глюкоамилазы в глубинной культуре на 120 часу роста равна 121 ед/мл, Пример2. В ферментер Биолафит Б-50 наливают 5 л воды, включают мешалку и, подогрев до 40 С, вносят 1,5 кг муки, затем наливают еще 5 л воды, вносят 1,2 кг пшеничных отрубей, объем суспензии доводят до 15 л ,рН,суспензии устанавливают 4,5, вносят 54 г целловиридина ГЗх и 100 г пектофостидина ГЗх, температуру суспензии поднимают до 50 С, выдерживают при этой температуре 60 мин, затем рН суспензии устанавливают 6,0 и вносят. 0,9 г амилосубтилина ПОх, растворенного в воде, поднимают температуру до , выдерживают при этой температуре 20 мин, затем в полученный гидролизат вносят вытяжку солодовых ростков и соли, как описано в примере I,

Приготовленную среду стерилизуют при этом же режиме, охлаждают до 40С и вносят посевной материал Aspergillus awamori. Культивируют при 33°С/ перемешивании и аэрации в течение 120 ч. Активность глюкоамилазы в глубинной кулЬтуре составляет 28 ед/мл.

П р и м е р 3. Приготовление среды осуществляют так же, как в прямере 1, но нараду с амилолитическимй, пектолитическими и целлюлолитическими ферментами в суспензию муки и отрубей вносят протеолитические ферменты в количестве 34,3 г.

При культивировании AspargilIus axramori на данной среде активность глюкоамилазы на 120 ч равна л 137 ед/мл.

П р и м е р 4. Приготовление гидролизата суспензии муки и пшеничных отрубей .ествляют так же, как описано в п римере 1. Полученный гидролизат фильтруют, твердую фазу используют дая л..зториого гидролиза, а в Ж1-ЩКУЖ фазу гидролизата муки и отрубей пкосят Oji;- л гидролизата 10% суспен. кразсмала О, J5 л кукурузноfo экстра:чта, О ,,60 л экстракта биомассы и соли, указанные в примере 1. Полученную среду стерилизуют, охлаждают, засевают Aspergillus awamori, культивируют при 33fС, аэрации и перемешивании в течение . Активность глюкоамилазы в глубинной культуре составляет 112 ед/мл, затем включают поток со скоростью 0,0208 и продолжают непрерывный процесс культивирования в течение 10 сут. Средняя активность глюкоамилазы в глубинной культуре составляет 65-75 ед/мл.

Таким образом, реализация предлагаемого изобретения позволит ускорить и упростить процесс приготовления среды, а также снизить затраты электроэнергии и расход муки сохранив высокую активность глюкоамилазы.

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТА-ТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ГЛ10КОАМИЛАЗЫ, предусматривающий приготовление суспензии муки, введение в суспензию амилолитических и целлюлолитических ферментов, гидролиз суспензии, добавление в гидролизат источников азота и минеральных солей с последующей стерилизацией среды, о тлич - с я тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса приготовления питательной среды, в суспензию муки дополнительно вводят пшеничные отруби, а также пектолитические ферRnr l :iti-.f iATHt;;f o. 13 13 ТГХН; 4М:%А«( К«1КЛИ01НЪ Гменты, причем содержание муки и отрубей в суспензии соответственно, 10-14 и 4-8 мас.%, а фрагменты вносят в суспензию в следующих количествах, ед/г смеси муки и отрубей: . Амилолитические ферменты1,5-10 Целлюлолитические ферментыО,1-1,0 Пектолитические ферменты0,1-1,0 2.Способ по п., отличающийся тем, что в сусп ензию муки дополнительно вносят протеолитическне ферменты в количестве 0,11,0 ед/г смеси муки и отрубей. 3.Способ 1ю ПП.1 и 2, отли(Л чающийся тем, что, с целью использования среды для непрерывных процессов культивирования продуцентов глюкоамилазы,из полученного гидролизата суспензии муки и отрубей выделяют жидкую фракцию, в которую дополнительно вводят гидролизат крахмала, а источники азота и минеральных солей вводят в смесь гидролизатов крахмала и суспензии муки и отрубей.