Способ получения целлюлазы Советский патент 1975 года по МПК C12D13/10 

Конидиеносцы в виде боковых ответвлений воздушного мицелия, большей частью вильчато или тройчато разветвленные, бесцветные. Фиалиды бутылевидные или конусовидные, слегка изогнутые, расположенные часто одиночно или мутовчато по 2-3 штуки размером 6-13X2,5-4,5 мкм. Конидии шаровидные овальные 2,5X3,5-4,0 мкм в диаметре, зеленые, скученные в шаровидные головки.

Предлагаемый способ осуществляют следуюш,им образом.

Культуру гриба Trichoderma lignorum 6С24 выраи1ивают на нитательной среде следуюшего состава, %: пшеничные отруби 55-60, свекловичный жом 20-25, солодовые ростки 25-15. Среду увлалиняют водопроводной водой до влажности 60-65%, стерилизуют при 0,8-1 ати 1 час, охлаждают до 35-38°С и производят засев споровой суспензии 4-5дневной культуры. Продолжительность выращивания 50-64 час при температуре 25- 32°С.

Активность культуры по осахариван.ию фильтровальной бумаги (Срфермент) 70- 80 ед/г, по разжижению натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (С -фермент) 40- 60 ед/г абсолютно сухой культуры.

Ферментный экстракт из культуры получают при соотношении абсолютно сухой культуры и воды 1 : 3,5-1 : 4.

Препарат целлюлазы выделяют из ферментных экстрактов одним из известных способов, используя органические растворители (этиловый или изопрониловый спирт, ацетон) или высаливанием. Осадок отделяют центрифугированием при 3000-4500 об/мин. Полученный препарат высущивают, например, лиофильно.

Выход препарата составляет 4-6% по весу культуры с активностью Сгфермента - 600- 700 ед/г, Са,-фермента - 450-600 ед/г.

Пример 1 (контроль). 20 г пшеничных отрубей, 20 г свекловичного жома смешивают и увлажняют водопроводной водой до влажности 60%.

Увлажненную питательпую среду помещают в колбу емкостью 500 см и стерилизуют в течение часа при 1 ати. Затем охлаждают до температуры 38°С и засевают споровой суспензией 5-дневной культуры гриба Trichoderma lignorum 6С-24.

Засеянную питательную среду помешают в кювету (толщина слоя 2,5 см). Продолжительность выращивания 60 час при 30°С.

Активность Сх-фермента - 23 ед/г абсолютно сухой культуры.

Активность С1-фе,рмента в готовой культуре - 29 ед/г.

Готовую культуру измельчают водой в количестве 350% (по абсолютно сухому весу). Экстракцию проводят 1 час при 30°С. Затем производят отжатие биощрота до влал ности 60%. Фильтрат центрифугируют при 6000 об/ /мин и используют для получения препарата.

Выделение препарата целлюлазы проводят этиловым спиртом при крепости в смеси 72°. Полученный осадок отделяют центрифугированием при 4500 об/мин.

Активность Сгфермента в лиофильно высушенном препарате 282 ед/г, активность Сжфермента - 226 ед/г.

Пример 2. 20 г ншеничных отрубей, 20 г свекловичного жома смешивают и увлажняют водопроводной водой до влажности 60%.

Увлажненную питательную среду помещают в колбу емкостью 500 см и стерилизуют в течение часа при 1 ати. Затем охлаждают до температуры 38°С и засевают споровой суспензией 5-д:невной культуры гриба Trichoderma lignorum 6С-24.

Засеянную питательную среду помещают в кювету (толщипа слоя 2,5 см). Продолжительность выращивания - 60 час при 30°С. Активность Сгфермента в готовой культуре- 43,5 ед/г, активность С -фермента- 34,5 ед/г абсолютно сухой культуры.

Готовую культуру измельчают, заливают водой в количестве 350% (по абсолютно сухому весу). Экстракцию проводят 1 час при 30°С. Затем производят отжатие биошрота до влажности 60%. Фильтрат центрифугируют при 6000 об/мин и используют для получения препарата.

Выделение препарата проводят этиловым спиртом дри крепости в смеси 72°. Полученный осадок отделяют центрифугированием 4500 об/мин.

Активность Ci-фермента в лиофильпо высушенном препарате 420 ед/г, активность C.vфермента - 340 ед/г.

Таким образом, предлагаемый способ получения целлюлазы с культуры гриба Trichoderma lignorum 6С-24, выращиваемой на питательной среде, содержащей, кроме пшеничных отрубей и свекловичного жома, солодовые ростки, позволяет повысить активност.ь фермента в 1,5 раза.

Пример 3. 22 г пшеничных отрубей, 10 г свекловичного жома и 8 г солодовых ростков смешивают и увлажняют водопроводной водой до влажности 60%. Увлажненную питательную среду помещают в колбу емкостью 500 см и стерилизуют в течение часа при 1 ати. охлаждают до температуры 38°С и засевают споровой суспензией 5-дневной культуры гриба Trichoderma lignorum 6С-24.

Засеянную питательную среду помещают в кювету (толщина слоя 2,5 см). Продолжительность выращивания - 60 час при 30°С.

Активность Сгфермента в готовой к -льтуре - 76 ед/г, активность С -фермента -60 ед/

/г абсолютно сухой культуры.

Готовую культуру измельчают, заливают водой в количестве 350% (по абсолютно сухому весу). Экстракцию проводят 1 час при 30°С. Затем производят отжатие биошрота до влажности 60%. Фильтрат центрифугируют при

6000 об/мин и используют для получения препарата.

Выделение препарата целлюлазы проводят этиловым спиртом при крепости в смеси 72°. Полученный осадок отделяют центрифугированием при 45000 об/мин.

Активность Сгфермента в лиофильно высушенном препарате - 700 ед/г, активность Сх-фермента - 585 ед/г.

Таким образом, культивирование новОГО продукта на предлагаемой среде позволило повысить активность фермента в 2,5 раза.

Культура гриба Trichoderma lignorum 6С24, выращенная по предлагаемому способу, может быть использована непосредственно, без выделения ферментного препарата, в сельском хозяйстве для силосования грубых кормов.

При действии целлюлазы на силосуемые растения увеличивается содержание редуцируюи1их Сахаров в 5-10 раз. Добавление целлюлазы при: силосовании кормов ускоряет процесс созревания силоса и сокращает потери питательных веществ.

Предмет изобретения

Способ получения целлюлазы путем культивирования грибов, относящихся к виду Trichoderma lignorum, цоверхностным способом на питательной среде, содержащей пшеничные отруби и свекловичный жом, отличающийся тем, что, с целью получения более активной целлюлазы из грибов вида Trichoderma lignorum, используют штамм 6С-24, а в питательную среду дополнительно вводят солодовые ростки при следующем соотнощении компонентов, %:

Пшеничные отруби55-60

Свекловичный жом20-25

Солодовые ростки25-15.