Способ количественного определения дезоксиниваленола в злаках и продуктах их переработки Советский патент 1988 года по МПК G01N30/90 

11

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть исполь- товано для определения в злаках и продуктах их переработки опасных загрязнителей, в частности один из его наиболее опасных и распространенных представителей этой группы - дезокси ниваленол (ДОН), обладающий высокими токсическими свойствами.

Цель изобретения - увеличение селективности разделения и повышение чувствительности анализа.

Способ осуществляется следующим образом.

Измельченную навеску зерна или муки экстрагируют смесью ацетонит- рил - вода в объемном соотношении 84:16 при встряхивании в течение 30 мин, фильтруют. Аликвоту фильтрата наносят на хроматографическую колонку с окисью алюминия и активированным углем. Колонку промывают порцией смеси ацетонитрила с водой в указанном соотнощении. Элюат удаляют в вакууме, После удаления основной массы растворителя к остатку добавляют изопропанол и упаривают в вакууме досуха. Сухой остаток растворяют в смеси хлороформ - ацетонит- рил (4:1) и наносят на ТСХ пластину с силикагелем. На ту же пластину наносят стандарт ДОН. Элюируют пластику в первом направлении в системе эфир - метанол - вода - бензол в соотношении 88-92:2,5-3,5:0,4-0,8: :2-4. По достижении фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 10 см от старта, пластинку извлекают из хроматографической камеры, сушат на воздухе, а затем помещают в систему растворителей хлороформ - ацетон - изопропанол - вода бензол в соотнощении 78-82:18-24:9- 11:0,8-1,2:2,5-3,5. При достижении фронтом растворителя контрольной четы пластинку извлекают из камеры, сшат на воздухе и опрыскивают 15%-ны спиртовым раствором хлористого алю

миния. После нат ревания пластинки при 100 С в течение 6 мин пластинку рассматривают в длинноволновом УФ- свете. ДОН идентифицируют по голубой флуоресценции и величине хроматографической подвижности, совпадающей с подвиж)юстью стандарта.

Концентрацию ЛОН (мг/кг) в образце- расс чцтывают по формуле

Y, Y.

.m 5000

где Y - объем раствора перед нанесением на ТСХ пластинку, мкл; Yj - объем раствора, нанесенный

на ТСХ пластинку, мкл; m - количество (нг) ДОН в

Y (мкл) раствора, оцененное денситометрическим или визуальным сравнением со стандартом на ТСХ пластинке. Пример 1. Анализ кукурузы на дезоксиниваленол по предлагаемому способу.

Отобранную пробу измельчают в течение 1-2 мин на лабораторной мельнице или в кофемолке. Навеску 25 г измельченного зерна кукурузы помеп;ают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 125 мл смеси ацетонитрила с водой в объемном соотношении 21:4. Встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр, отбирая 25 мл фильтрата.

В стеклянную хроматографическую колонку с в-нутренним диаметром 10 мм на дно помещают кусочек ваты, насыпают 0,75 г окиси алюминия и сверху слой активированного уг ля 0,75 г, предварительного растертого в ступке . Над слоем угля помещают кусочек ваты. Приливают в колонку 25 мл экстракта анапизируемой кукурузы, со- ответствующие 5 г исходного образца. Отбирают элюат и, не давая колонке просохнуть, добавляют еще 10 мл смеси ацетонитрил - вода в указанном соотношении. Объединенные элюаты фильтруют через бумажный складчатый фильтр в колбу на 50 мл, бумажный фильтр промывают 7 мл изопропилового спирта в ту же колбу. Фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 5 мл. Добавляют 15 мл изопропилового спирта и повторно упаривают на ротационном испарителе досуха.Остаток в колбе после упаривания не должен содержать капель воды.

5В

Остаток в колбе растворяют в 150 мкл смеси хлороформ - ацетонитрил в объемном соотнощении 4:1 (раствор А) .

3

Пластинку Силуфол размером 15X15 см размечают легкими карандашными линиями следующим образом. На расстоянии 1,5 см от сторон пластинки проводят две взаимно перпендикулярные линии, каждая из которых параллельна ближайшей стороне пластинки. В точку пересечения этих линий (в правом нижнем углу) наносят с по- мощью микроишрица 15 мкл раствора А. В правом верхнем и левом нижнем угла пластинки на расстоянии 1,5 см от сторон наносят 2, 3, 4 и 6, 8 мкл стандартного раствора ДОН (концент- рацией 20 нг/мкл) соответственно. Расстояние между пятнами стандартов 6-8 мм. Пластинку помещают в камеру для тех со смесью растворителей зфир - метанол - вода - бензол в объемном соотношении 90:3:0,5:3 и р.азливают ее в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 3-х см от верхнего края пластинки. Плас- тинку извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. Затем развивают пластинку во втором, перпендикулярном, направлении в системе растворителей хлороформ - ацетон - изопропанол - вода - бензол в объемном соотношении 78:22:10:1 :3.

После достижения фронтом растворителя контрольной линии, проведенной в 3-х см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. Пластинку опрыскивают 15%-ным раствором 6-водного хлорис

,того алюминия в этиловом спирте, нагревают -6 сушильном шкафу при lOO С в течение 5 мин, затем рассматривают в длинноволновом (365 нм) УФ-свете.

Дезоксиниваленол проявляется в виде пятен с синей флуоресценцией. Наличие в экстракте пятен, соответствующих по цвету флуоресценции и хро- матографической подвижности пятнам ДОН, свидетельствует о наличии в анализируемом образце ЛОН. Для количественного определения ДОН проводят флуороденситометрию пятен стандартов и пятна ПОИ в экстракте или сравнивают интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта ЛОН с интен- СИВНОСТ1.Ю ei o пятен в образце, при- близит( чык (щенивая количество дез- оксинин.ч. 1е-1И)ча (раО в нанесенных на пллс типку обт.емах растр 1ря Л,

Концентрацию ДОН (мг/кг) в образце рассчитывают по формуле

У

Y.

ID 5000

где Y, Y

m объем раствора А, мкл; объем раствора А, нанесенны на пластинку, мкл; количество ДОН (нг) в объем раствора А (мкл), оцененное денситометрическим сравнением со стандартом на ТСХ пла тинке.

При рассматривании пластинки в УФ-свете обнаруживается пятно с синей флуоресценцией, находящееся на пересечении перпендикуляров к направлениям развития хроматограммы, проведенных через центры пятен стандартов. Проведя денситометрическое определение интенсивности флуоресценции пятен ДОН, определяют, что пятно экстракта соответствует 110 нг ДОН. Концентрация ДОН в кукурузе С 0,22 мг/кг.

Таким образом, в 1 кг данного образца кукурузы содержится 0,22 мг дезоксиниваленола.

Пример 2. Анализ пшеницы на Дезоксиниваленол по предлагаемому способу.

5

0

5

0

5

Анализ проводят аналогично примеру 1. По данным флуороденситометрии пятно экстракта соответствует 432 нг ДОН.

Концентрация ДОН в пшенице С 0,92 мг/кг.

Таким образом, в 1 кг образца пшеницы содержится 0,92 мг ДОН.

Пример 3. Анализ кукурузы на Дезоксиниваленол по предлагаемому способу.

К образцу кукурузы добавляют ДОН на уровне 0,25 мг/кг и осуществляют анализ аналогично примеру 1. Хрома- тографическую пластинку с нанесенными пятнами стандарта и экстракта элю- ируют в двух направлениях в оцноц, и той же системе растворителей эфир - метанол - вода - бензол в объемном соотношении 90:3:0,5:3. После обработки пластинки хлористым алюминием и нагревания определяют содержание ДОН методом флуороденситометрии. Пятно токсина частично перекрывается-с пятном одного из компонентов экстрлкта, флуоресцирующего синим цветом и похожим на пятно ДОН, из-за чего его количественная оценка затруднена. На десиНтограмме плошади пиков токсина и примеси перекрываются приблизительно на 30%,

Таким образом, при использовании одной и той же системы растворителей в двухмерной тех возможно получение ложноположительного вывода о наличии ДОН в образце из-за близких хроматог рафических параметров ДОН в примеси, содержащейся в экстракте.

Пример А. Анализ кукурузы на дезоксиниваленол по предлагаемому способу.

Анализ осуществляют аналогично примеру 5, Хроматографическую пластинку элюируют в двух направлениях в одной и той же системе растворителей хлороформ - ацетон - изопропа- нол - вода - бензол в объемном соотношении 78:22:10:1:3. Дальнейшую обработку проводят аналогично примеру 1 и определяют содержание ДОН с помощью флуороденситометрии. Пятно ДОН, содержащегося в экстракте, перекрывается с пятном одного из компонентов экстракта, флуоресцирующего синим .цветом и похожим на пятно ДОН, из-за чего его идентификация и количественное определение затруднены. На денситограмме площади пиков токсина и примеси прекрываются более, чем на 60%.

Таким образом, при использовании одной из предлагаемых систем растворителей в двух взаимно перпендикулярных направлениях возможно получение ложноположительного результата наличия ДОН в исследуемом образце из-за близких хроматографических параметров ДОН и флуоресцирующей примеси, содержащейся в экстракте.

Формула изобретения

Способ количественного определения дезоксинивапенола в злаках и продуктах их переработки, включающий экстракцию образца, очистку его колоночной хроматографией, нанесение пробы образца на тонкослойную пластину с силик гелем, элюирование пробы в системе органических растворителей, идентификацию и количественное определение дезоксиниваленола по флуорес- ценции после обработки пластины проявляющим агентом, отличающийся тем, что, с целью улучшения селективности разделения и повышения чувствительности анализа, осуществляют двухмерное злюирование пробы в системе растворителей: эфир - метанол - вода - бензол в объемном соотношении 88-92:2,5-3,5:О,4-0,8:2-4 и хлороформ - ацетон - изопропанол - вода - бензол в объемном соотношении 76-82:18-24:9-11:0,8-1,2:2,5-3,5,

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения в злаках и продуктах их переработки токсичных з агрязнений, в частности деЭоксини- валенола. Цель изобретения - улучшение селективности и повышение чувствительности анализа. FlaaecKy зерна или муки экстрагируют смесью ацето- нитрил-вода в объемном соотношении 84:16, фильтруют, пробу фильтра подают в хроматографическую колонку и элюируют тем же растворителем. К полученному элюату добавляют изопропа- нол и упаривают в вакууме. Сухой остаток, растворенный в смеси ацето- нитрил-хлороформ (4:1), наносят на тех пластину. Затем осуществляют двухмерное элюирование пробы в системе растворителей: эфир-метанол-вода-бензол в объемном соотношении 88- 92:2,5-3,5:0,4-0,8:2-4 и хлороформ- ацетон-изопропанол-бензол в объемном соотношении 76-82:18-24:9-11:О,8- 1,2:2,5-3,5. Проявляют хроматограмму 15%-ным спиртовым раствором хлористого алюминия с последующим нагреванием пластины и УФ-облучением. Дезоксини- валеном идентифицируют по голубой флуоресценции и величине хроматогра- фической подвижности, совпадающей с подвижностью стандарта. (/. С со О5 СО Г)