Способ получения конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа с синтетическими полиэлектролитами Советский патент 1984 года по МПК A61K39/395 

Изобретение отнсх;ится к сшгтезу биологиче ки активных соединений, конкретно к способ получения конъюгатов гемагглютншша i; полимерами - полиэлектролитами. Известен способ получения коныогатов взаимодействием очень слабого иммуногена - бычьего сывороточного альбумина с кватернизованным поли-Фвинилпиридлном . Иммунизация полученными конъюгатами вызывает иммунный ответ с накоплением специфических антителообразующих клеток (на альбумин), число которых значительно превышает число ютеток, накапливающихся при раздельном введении животных альбумина и кватер}шзованлого поли-4-ви шлпиридина 1. Однако )Югаты альбумин- поли-4-винилпиридин не могут найти широкого правстического применения, так как кватернизованный поли-4-винилпиридин является весьма токсичным полимером (LD - 80 мг/кг) и, кроме того, получение высоких титров против альбу мина не является актуальным для современной иммунологии. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положител ному эффекту является способ получения конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа с синтетическими полиэлектролитами, заключающийся в ковалентном связывании гемагглю тинина с ацилированными карбодиимидом полиэлектролитами, причем в качестве полиэлектролитов используют гетерогенные поли амины 2. Недостатком способа является низкая продолжительность иммуногенного действия полученных конъюгатов - не более 12 сут (табл. 1). Целью изобретения является пролонгирование иммуноге1шости делевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения конъюгатов гемаггл тинина вируса гриппа с синтетическими полизлектролитами путем ковалетного связывания гемагглютинина с ацилированными карбодицидом полизлектролитами, в качестве полиэлектролитов используют сополимеры акриловой кислоты и N-винилпирролидона. CyniHocTb предлагаемого способа состоит в ковалентном связывании по реакции ацилирования карбодиимидным способом сополимера акриловой кислоты и N-винилпирролидона с гемагглютинином в буферном растворе (рН 6,8), с ионной силой 0,1 - 1,0 М NaCI при 2-4°С. В качестве ацилируюшего агента используют водорастворимый п-толуолсульфат-N- 2- (4-морфолиний) этил карбо/даимид Ковалентное связывание гемагглютинина вируса гриппа осуществляют с полимерами различных составов И молекулярных масс. Используют сополимеры, содержащие 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 мол.% акриловой кислоты и с мол. мае. 10000 и 200000. Конъюгат отделяют от несвязавшегося белка и сополимера гель-фильтрацией на колонке с сефадексом. Высзшивают лиофильно. Идентифицируют полученные конъюгаты по электрофоретической подвижности, которая отличается от подвиж- ности гемагглютинина и сополимера. Количест во связавшегося белка определяют с помощью УФ-спектроскопии и методом Лоури, количество ковалентных связей оценивают по результатам спектрофотометрического титрования свободнь1х аминогрупп тринитробензолсульфокислотой. Для иммунологических экспериментов используют конъюгаты, содержащие от 50 мкг до 1 мг гемагглютинина на 1 мг конъюгата с количеством ковалентных связей 5-209о. Установлено, что полученные конъюгаты устойчивы к биодеструкции и выводятся из организма крайне медленно. Эффект вакцины определяется величиной и длительностью протективного действия. В случае устойчивых к биодеструкции соединений длительность воздействия на иммуносистему организма увеличивается. Это важно с точки зрения пролонгирования эффекта вакцины путем увеличения времени циркугтяции конъюгата в кровотоке, а также включения новых клонов клеток иммунной памяти. Устойчивые к биодеструкции синтетические полимеры позволяют пролонгировать иммунные и вакцинирующие свойства конъюгатов на их основе. Пример. Сополимеры акриловой кислоты и N-винилпирролидона получают методом радикальной их сополимеризавди в присутствии радикального инициатора - надсернокислого аммония 3. Состав мономерной смеси определяют с учетом известных констант сополимеризации мономеров. Сополимеры выделяют осаждением в эфир, затем диатизируют и высушивают лиофильно. Содержание акриловой кислоты в сополимере определяют ИК-спектроскопии (1720 см ) и потенциометрическим титрованием. Молекулярные массы оценивают вискоэиметрически. Синтез конъюгата проводят по реакции ацилирования в присутствии водорастворимого карбодиимида - П-толуолсульфоната-Ы-цикло-гексил-N- 2(4-морфолиний) этил карбодиимида. 30 мг сополимера (мол. мае. 100000, эквимольного состава 50:50) растворяют в 2 мл фосфатного буфера (рН 6,8, ионная сила 0,1 М NaCl). К раствору сначала добавляют 2 мг гемагглютинина в 0,5 мл того же буфера, а затем при перемешивании и

охлаждении (2-4С) 20 мг карбодииноща в 0,5 мл буфере. Раствор вьщерживают в течение 24 ч при перемешивании и охлаждении, затем добавляют 0,1 ммоль ацетата натрия.

Несвязанные ковалентно белок и ал по лимер разделяют с помощью гельхроматографии на колонне (1,7x80 см), заполненной се адексом G-150, скорость элюирования 50 мл/ч. Элюирование проводят 0,05 М фосфатным буфером (рН 8,2) с ионной сило 1,0 М NaCl. Раствор диапизуют через полупроницаемую целлофановую мембрану сначала против 0,15 М NaCl, затем против дистиллированной воды в течение 48 ч. Раствор высушивают лиофильно.

Количество связанного белка, определенного по методу Лоури и с помощью УФ-спектроскопии (280 нм), 100 мкг на 1 мг конъюгата. Количество ковалентных связей, определеш1ых спектрофотометричемким титрованием свободных аминогрупп тринитробензолсульфокислотой, 17%.

Сополимеры различного состава и молекулярной массы, а также конъюгаты на их основе различного состава, содержащие различное количество ковалентных связей получены способом аналогичным примеру.

Изучение иммуногенности конъюгата, полученных согласно примеру.

Опыты проводили на мышах .линии СВА и СВАХС57 В /F, весом 22-24 г. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно изолированным гемагглютинином, смесью гемагглютинин сополимер и конъюгатом гемагглютинин-сополимер. Через 7-8 дней после иммунизации в

селезенке животных определяли содержание актителообразующих клеток, используя зритроЩ1ТЫ барана, нагруженные вирусом гриппа.

Реакцию гкперчувствительности заме).1ленного типа против гёмаглютинина индуцировали внутриОрюшинной иммунизацкгй животных изолированным гемагглюнитином, смесью гемаплюганина с сополимером или конъюгатом.

В табл. 1 приведены данные о пролонгирова№1И иммуногенности полученных конгьюгатов по сравнению с иммуногенностью конъюгатов, полученных по известному способу. Получе1шые по предлагаемому способу конъюгаты сохраняют иммунологическую активность по крайней мере в течени 18 сут, тогда как, конъюгаты гемагглютинина с производными гетероцепных полиаминов в течение 12 сут.

При исследопании конъюгатов обнаружено повышение иммуногенности в 44 раза (табл.2) Анализ специфичности указывает на строгую гемагглютинин -специфичность антителообразующих клеток. Иммунизация конъюгатом обеспечивает развитие значительно более выраженной реакции гиперчувствительности, высота которой превышает в 11 раз таковую в ответ на введение изолированного гемагглютина.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получить также конъюгаты гемагглютинина с полиэлектролитами, которые обладают прологированными иммуноreifflbiMH свойствами, сохраняя при зтом высокую иммуногенность, специфичность и способность обеспечить при этом развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЬЮГАТОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАМИ путем ковалентного связывания гемагглютинина с ащшированкыми карбодиимидом полиэлектролитами, отличающийся тем, что, с целью пролонгирования иммуногенности целевого продукта, в качестве полиэлектролитов используют сополимеры акриловой кислоты и N-винилпирролидона. (Л

5050100 3244 4444 4060100 2030 3030 6040100 3540 4040 40100 10070 Полиамины

Для сравнения приведены данные по изменению иммунологической активности по времени конъюгатов гемагглютинина вируса гриппа на биодеструктирующих носителях - производных гетероцепных полиаминов

Таблица 1 444040383534323025 303028282525242420 403737373535322525 3020. 10О

30Гемагглютинин100

30Смесь гемаглютинин-сополимер 50:50100

30Конъюгат гемагглютинин-сополимер 50:50100

Таблица 2

80

300

44

3500