Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS,используемый для получения моноклональных антител к гемагглютинину вируса гриппа А /Краснодар/ 101/59(Н @ N @ ) Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 

4

О)

сд

а

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики гриппа.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musclus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к гемагглютинину вируса гриппа типа А,

Штамм получают следующим образом.

Для иммунизации используют шестинедельных самок мышей линии BALB/c. Схема иммунизации животного включает внутрибрюшинное Б1(едение концентри-15 Селекцию гибридных клеток проводят

0,83%-ным раствором в 5-кратном объеме. После лизиса эритроцитов клетки потворно осаждают и дважды промывают в бессывороточной среде RPMI-1640 или ДМЕМ. Для слияния используют 50%-ный раствор полиэти- ленгликоля с мол. массой 1000.

Иммунные спленоциты сливают с клетками NSO в соотношении 5:1. Иммунные спленоциты от двух мышей сливают с клетками NSO и распределяют в 20 96-луночных пластин со слоем - коръшлкой из неиммунных спленоцитов.

Изобретение относится к биотехйологии и может быть использовано для диагностики гриппа. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus, продуцируище го Моноклональные антитела (МКА) к гемагглютинину вируса гриппа типа А. Штамм получают гибридизацией сплено- цйтов мьшей линии BALB/c, иммунизированных вирусом гриппа А(Краснодар) Т01/59 (H2N2), с клетками миеломы NSO. МКА относятся к классу (К). Они специфически взаимодействуют с гемагглютинином вирусов гриппа типа А в реакциях непрямой иммуно флюоресценции, торможения|.гемагглюти- нации, нейтрализации на куриных зм- брионах. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении 70 пассажей in vitro и 5 пассажей, на мышах линии BALB/C. 3 табл. i (Л

рованного и очищенного вируса гриппа А(Краснодар) 101/59 (H2N2). Доза вируса составляет 100 10 ГАЕ на мьшь в объеме 0,5 мл в полном адью- ванте Фрейнда. Через две недели вводят антиген в той же ддзе в полном адъюванте Фрейнда, За три дня до слия-. йия внутривенно вводят О,1 мл антигена в солевом буферном растворе в дозе 50И03 ГАЕ на мышь.

В качестве злокачественного партнера применяют мышиную миеломную линию NSO. Клетки NSO вьфащивают в стационарных условиях в пластиковых 800 мл матрицах. За неделю до слияния их поддерживают в фазе логарифмического роста путем ежесуточного пересева в новые матрицы с индексом .1:2-1:3. Миеломные клетки выращивав среде HAT, составленной из ростр- вой среды с м гипоксантина, 1,6-10- М тимидина и 4 аминоптерина.

20 Начиная .с 3-х суток с момента культивирования и в последующие дни в лунки культуральных пластин каждые 3-4 дня вносят по 2 капли свежей селективной среды или из пластин

25 удаляют О,1 мл культуральной среды и заменяют на свежую. Начиная с 20 сут с момента культивирования клетки из лунок, в которых наблюдает ся рост гибридных клеток, пересевают

30 в 24-луиочные пластины со слоем - кормилкой из неиммунных спленоцитов. Неиммунные спленоциты ресуспендируют в среде НТ (селективная среда без аминоптерина) и по О,1 мл распределяют в ростовой среде следуняцего срста-з5 ют в 24-луночные пластины (спленоци- ва: среда RPMI-1640 или ДМЕМ с 0,13% ты, полученные от одной мыши, распре- NaHCOj, глюкозой До 4 г/л, 5% сыворотки эмбрионов коров и 5% сыворотки суягных овец, очищенной полиэти- ленгликолем, пируват натрия 0,05 40 мг/мл, оксалоацетат 0,15 мг/мл, инсулин 0,2 ед/мл, 2-меркаптоэтанол

5-10 М, HEPES 5-10 шМ, гентамицин

)- 50 мкг/мл.

Иммунные спленоциты получают на 45 третий день после бустерной внутривенной инъекции антигена мьшам из стерильно извлеченных селезенок. Спленоциты извлекают путем многократного введения в пульпу селезенки О 0,1-0,2 мл холодной ростовой среды RPVI-1640 или ДМЕМ с помощью тонкой иглы со шприцем.

Извлеченные спленоциты собирают в пластиковые охлажденн| 1е пробирки, j осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок клеток с эритроцитами обрабатывают в течение 5 мин на холоду

деляют на две 24-луночные пластины) . Клоны гибридных-клеток, растущие в 24-луночных пластинах со слоем - кормилкой, выращивают до формирования сплошного слоя, а затем клетки пересеваю,т в 24-луночные пластины без слоя - кормилки. Через 10-14 дней проводят замену гибридомной среды с высоким содержанием сыворотки на среду со сниженной концентра- цией сьгооротки (2-4%).

Скрининг супернатантов из растущих гибридных культур проводят с пемощью твердофазного варианта имму- ноферментного анализа (ИФА), Антигены вирусов гриппа А для ИФА готовят путем инфицирования клеток почки собак (линия МДСК). В качестве контрольного антигена служат аналогичным образом приготовленные неинфи щров,ан- ные клетки МДСК. Антителопродуцирую- щие клоны гибридных клеток выращивают в пластиковых флаконах площадью

в среде HAT, составленной из ростр- вой среды с м гипоксантина, 1,6-10- М тимидина и 4 аминоптерина.

Начиная .с 3-х суток с момента культивирования и в последующие дни в лунки культуральных пластин каждые 3-4 дня вносят по 2 капли свежей селективной среды или из пластин

удаляют О,1 мл культуральной среды и заменяют на свежую. Начиная с 20 сут с момента культивирования клетки из лунок, в которых наблюдает ся рост гибридных клеток, пересевают

в 24-луиочные пластины со слоем - кормилкой из неиммунных спленоцитов. Неиммунные спленоциты ресуспендируют в среде НТ (селективная среда без аминоптерина) и по О,1 мл распределяют в 24-луночные пластины (спленоци- ты, полученные от одной мыши, распре-

деляют на две 24-луночные пластины) . Клоны гибридных-клеток, растущие в 24-луночных пластинах со слоем - кормилкой, выращивают до формирования сплошного слоя, а затем клетки пересеваю,т в 24-луночные пластины без слоя - кормилки. Через 10-14 дней проводят замену гибридомной среды с высоким содержанием сыворотки на среду со сниженной концентра- цией сьгооротки (2-4%).

Скрининг супернатантов из растущих гибридных культур проводят с пемощью твердофазного варианта имму- ноферментного анализа (ИФА), Антигены вирусов гриппа А для ИФА готовят путем инфицирования клеток почки собак (линия МДСК). В качестве контрольного антигена служат аналогичным образом приготовленные неинфи щров,ан- ные клетки МДСК. Антителопродуцирую- щие клоны гибридных клеток выращивают в пластиковых флаконах площадью

14461

25 см со слоем - кормилкой из сплг- ноцитов и после накопления клеток в достаточном количестве (сплошное покрытие ростовой поверхности флакона) проводят оценку МКА в культуральных жидкостях (кж) на активность и специ- фичность. По данным проведенного исследования осуществляют выбор клонов для их накопления, в массовой культу- io ре и криоконсервации

В результате слияния получают коллекцию гибридов с различной реактивностью к вирусу гриппа А(Краснодар) 101/59 (H2N2).15

Наиболее продуктивный штамм выводят в массовую культуру и обозначают Кр 3-30. Штамм Кр 3-30 хранится в Спеид ализированной коллекции перевиваемых соматических клеток 20 позвоночных Институт.а Цитологии АН СССР под номером 88D и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Морфология клеток гибридомы Кр 3-30 не от- 25 личается от родительской линии. Клетки округлой формы, размножаются в суспензионном состчзянии и обладают слабой адгезией к поверхности гшасти ка или стекла.30

Культуральные признаки. Среда для культивирования - RPMI-1640 шш ДМЕМ с 0,13% , глюкозой до 4 г/л, 5-10% сыворотки эмбрионов ; коров или суягных овец (очищенной полиэтиленгликолем), пируватом натрия (0,05 мг/мл), оксалоацетатом (Oj15 мг/мл), инсулином (0,2 ед/мп), 2-меркаптоэтанолом (5--10 М), HEPES- буфером (5-10 тМ). Температура куль- тивирования 36,5 С.

Клетки растут в суспензии, обладают слабой адгезивной способностью к поверхности пластика или стекла. Посевная доза 200-300 10 клеток/мл, .кратность рассева 1:4-1:6, пассаж , два раза в неделю.

Культивирование гибридомы в орга низме животного. Самок мышей BALB/c ; в возрасте 2-2,5 мес сенсибилизируяй- С,5 мл пристана внутрибрюшинно за 7-10 дней до введения 2-4--10 гйбрид- -гых клеток, через 10-14 дней формируется асцитная опухоль. Перевивав гОСТь гибридом в 100% случаев. Цро- ауктивность штамма. Титр МКА, выяв --емьй с помощью иммуноферментного -. нализа, составляет 1-4:10 в куль I

туральной жидкости, 1:10 в ас7 1;ити

45

50

o

5

0

5 0

5

0

56

ческой жидкости (аж). Стабильная продукция антител сохраняется на про тяжении 70 пассажей in vitro и 5 пассажей на мьшах BALB/c.

Характеристика полезного продукта. МКА относятся в классу (К). Они специфически взаимодействуют с гемаг- глютинином вируса гриппа А(Красно- дар) 101/59 (H2N2),

Активность МКА в реакции непрямой иммунофгаооресценции (НИФ) составляет 1:102 (кж) и 1:10 (аж), в реакции торможение генагглютйнации (РТГА) - 1:103 (кж) и 1:5,140 (аж) в реакции нейтрализации (РН) на кури- ньк эмбрионах (со 100 ЭВД вируса) - 1:3,2-103 (аж).

Контаминация,.Гибридома свободна от бактериальных контаминантов и микоплазм.

Криоконсервирование. Среда для замораживания - сыворотка эмбрионов коров 90%, диметилсульфоксид 10%. 1 мл клеточной суспензии с плотностью не ниже 2-10 жизнеспособных клеток, ресуспендированных в холодном крио- консерванте, переносят в пластиковые 1,8 мл ампулы, укладьгеают в пенопластовую коробку с толщиной стенок не менее 1,5 см и немедленно помещают на холод (-70)- (-80) С. На следующие сутки ампулы переносят в жидкий азот. Замороженные ампулы оттаивают в воде при 37-39°С. Клетки разводят в 10 раз эмбриональной сьшороткой и осаждают центрифугированием при 500 об/мин в течение 10 мин. Восстановленные клетки ресуспёндируют в ростовой среде концентрации 2,5 . Ю - 3,0.-10 ;кизнеспособных клеток в 1 мл, переносят в пластиковые куль- тур-алыше флаконы. Жизнеспособность после размораживания составляет 40- 60%, устанавливаемые по дифференциаль- ;ной окраске клеток с помощью 0,25%- ного раствора трипанового синего.

Пример. МКА вьщеляют из аж с помощью 20% полиэтиленгликоля, мол. массы 6000 и приготавливают на их основе иммуноферментный конъюгат (соотношение белка, и перексидазы 2: :1), иммунофлюоресцентный коньюгат (соотношение красителя ФИТЦ и белка 1:50) и эритроцитарньй антительный диагностикум для реакции обратной i пассивной гемагглютинации (РОПГА) .,

Результаты исследования полученных диагностических препаратов с .анвирусологической диагностике.

п:. Dp мула изобрете

в табл.1-3.

Результаты, приведенные в табл. 1-3, свидетельствуют с высокой акткь ности и специфичности полученных ди агностшгеских препаратов„ При этом МКА узнают общий эпитоп на гемагглю- тинине вирусов гриппа типа .) и могут быть использованы для идеи- ю нину вируса, гриппа А(Краснодар) тификации вирусов данного типа в клй- 101/59 (H2N2),

Штамм гибридных культивируем клеток животных Mus musculus ВС М 88 Dj используемый для получе моноклональных антител к гемагг

Контроль A/PR/8 (34/HINI)

Вирус кори (л-15)

Примечан

Контроль: A/PR/8/34 (H1N1)

Вирус кори (Л-16) Клетки ВДСК

П р и м е ч г) } I и е.

+4 - свечение .100% клеток в поле зрения; +3 - свечение . 75% клеток в поле зрения; - - отсугсткие свечения.

вирусологической диагностике.

п:. Dp мула изобретения

нину вируса, гриппа А(Краснодар) 101/59 (H2N2),

нину вируса, гриппа А(Краснодар) 101/59 (H2N2),

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (П М 88 Dj используемый для получения моноклональных антител к гемагглютиТаблица 1

активность MKAj уело ед,

отсутствие

Таблица 2

Вирус гриппа А

(Краснодар) 101 512 32

Вирус кори О О

Таблица

О О

512 О