Способ получения ингибитора полимеризации фибрина Советский патент 1984 года по МПК C12N9/48 A61B10/00 

д

д

9) СО

сл

Изобретение относится к медицине, а именно к способам выделения факторов, тормозяпшх процесс полимеризации (самосборки) биополимеров, и может быть использовано для получения ингибитора полимеризации в целях уточнения представлений о его свойствах, структуре и механизме участия в процессе полимеризации фибрина;

Известен способ получения ингибитора полимеризации фибрина из крови, включающий вьщеление фибриногена шсаливанием, гидролиз фибриногена трипсином, диализ, хроматографию на КМ-цеш;юлозе и лио4 1лизаци1о {VJ .

Недостатки способа - сложность, длительность процесса (350 ч) и получение целевого продукта, содержащего в качестве примеси низкомолекулярные соединения.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения Ингибитора полимеризации брина из сыворотки крови, включанавий отделение фибриногена, диализ сыворотки через целлофан типа купрофан со средним днаметром пор 2,04 А, выпаривание диализата и отделение ингибитора от низкомолекулярных соединений с помощью хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе А 25 2 .

Недостатками известного способа являются длительность (80,5 ч) и прИ сутствие примесей (аминокислот) в целевом продукте.

Цель изобретения - повьвпение чистоты целевого продукта и ускорение процесса.

Поставленная цель достигается тем что при способе получения ингибитора полимеризации фибрина из сыворотки крови, включающем отделение фибриногена, диализ сыворотки через целлофан, выпаривание диализата и отделение ингибитора от низкомолекулярных соединений, диализ проводят через целлофан с порами диаметром 1,66-1,82 X, а отделение ингибитора от низкомолекулярных примесей проводят гель-фильтрацией на сефадексе g-15 в присутствии 0,04 - 0,05 М аммонийно-ацетатного буфера с рН 7,47.6,

Сущность способа заключается в том, что замена целлофана Купрофан со средним диаметром пор 2,05 А на целлоАан диаметром пор 1,661,82 А обеспечивает более эф4)ективНое отделение высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных, что исключает необходимость дополнительной очистки на ДЭАЭ-сефадексе А 25, а гель-фильтрация на сефадексе позволяет получить чистый целевой продукт.

Пример 1. 10 МП стабилизированной цитратом натрия (3,8%, 9:1) плазмы крови нагревают на водяной бане (5бс) в течение 10 мин, затем полученную сыворотку освобождают от вьтавшего фибриногена центрифугированием (1 250 g, 15 мин). Освобожденную от фибриногена жидкость (сыворотку) диализируют через ц§ллофан Т-100 (диаметр пор 1,66-1,82 А) против дистиллированной воды (1:50), сменяя воду через каждые 4 ч (всего 4 раза).

Диализ через целлофан Т-100 приводит к получению препарата, свобод-. ного от белковых высокомолекулярных примесей, тогда как при диализе через Купрофан не происходит полного отделения белков.

Порции диализата концентрируют выпариванием на кипящей водяной бане по мере их получения.

Полученный концентрированный диалзат (2-3 мл) вносят в колонку с сефадексом Q -15, уравновешенную 0,04 М аммонийно-ацетатным буфером при рН 7,4. Элюируют зтим же буфером, собирая фракции по 2 мл и в каждой из них определяют наличие ингибитора полимеризации. Порции злюата, содержащие ингибитор полимеризации, объединяют и удаляют летучий буфер выпариванием на выпарительных чашках (кипящая водяная баня) до полного удаления буферного раствора. Сухой остаток на чашках растворяют в необходимом количестве дистиллированной воды - целевой продукт. Выход продукта 99%.

Пример 2. Проводят по примеру 1, но при гель- вшьтрации используют буферы с другими параметраtm: 0,05 М срН 7,6 (выход 99,0%), 0,05 М с рН 7,4 (выход 97,4%) и 0,04 М с рН 7,6 (выход 97,0%).

311226954

Длительность процесса прлученйя рафии на бумаге в системе бутанол ингибитора и его чистота не изменяют-ледяная уксусная кислота - вода

ся при варьировании параметров бу-в соотношении 4:1:5 (двукратное

фера в указанных пределах.пропускание) и 4:1:1 (двукратное

Время, необходимое для получения sпропускание) не содержит примесей

ингибитора, составляет 25,5 ч.аминокислот.

При многократном применении спосо- Таким образом, предложенньй

ба выход ингибитора 97-100% от егоспособ позволяет получатьингибитор

содержания в исходном материале.полимеризации фибрина, свободный

Получаемый предлагаемым способом Юот примесей, а также в раза усЦ1елевой: продукт по .данным хррматог-корить процесс.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПОШ1МЕРИЗАЦИИ ФИБРИНА из сыворотки крови, вкпючакиций отделение фибриногена, диализ сыворотки через целлофан, вьтаривание диализата и отделение ингибитора от низкомолекулярных соединений, отличающи и с я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта и ускорения процесса, диализ проводят через целлофан с порами диаметром 1,66-1,82 X, а отделение ингибитора -от низкомолекулярных примесей проводят гель-ф€льтрацией на сефадексе -15 в присутствии 0,040,05 М аммонийно-ацетатного буфера с рН 7,4-7,6. (Л