Способ получения нуклеазы @ Советский патент 1985 года по МПК C12N9/22 

Изобретение относится к молекуля ной биологии, а именно к способу по лучения нуклеазы S (КФ 3.1.30.1J о ноцепочной нуклеинат-5 -олигонуклео тид гидролазы), применяемой в молекулярной биологии при изучении первичной структуры дезоксирибонуклеиновых кислот и рибонуклеиновых кислот. Фермент также применяется в ге нетической инженерии при получении рекомбинатных ДНК. Известен способ получения нуклеа зы S., основанный на использовании ионообменной хроматографии на ДЭАЭ- целлюлозе l Однако из-за недостаточной очист ки препарат содержит примесь других ферментов. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения нуклеазы Sy из , амилоризина, включающий стадии экстракции, термообработки, фракционирования сульфатом аммония, диализа, хроматографии на диэтиламиноэти целлкшозе, концентрирования, гельфильтрации на сефадексе Г-75 и повторного концентрирования, причем концентрирование приводится с помощью хроматографии на ДЭ-32 (3-кратной) . Способ включает также стадию хроматографии на сульфо-сефадексе 2. Недостатками способа являются ег сложность (16 стадий, причем 6 из них - хроматография на ионоо0менниках), использование импортных сор бейтов (ДЭ-32 фирмы Ватман, сульфосефадекс и сефадекс F-75 фирмы Fanaacia), а также неполное отделение от загрязняющих целевой продукт ферментов, Цель изобретения - увеличение чистоты целевого продукта и упрощение способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения нуклеазы S./ из амилоризина, включаю щему стадии экстракции, термообработки, фракционирования сульфатом аммония, дийлиза, хроматографии на дяэтиламиноэтилцеллкшоэе, Концентрирования, гель фильтрации на сефадексе Г-75 и повторного концентрирования, после диализа рдствор нуклеазы депигментируют активированным углем, при хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе сорбцию осуществляют в 0,05-0,075 М ацетате аммония с рН 5,2-5,6, а десорбцию осуществляют ацетатом аммония сначала с удельной электропроводностью (12-14) У .м для Отделения балластных белков, а затем с электропроводностью (23-30) для элюций нуклеазы, концентрирование проводят удьтрафиль рацией через мембрану из сополимера метилметакрилата и N-винилпиролидона с радиусом пор 50150 мкм, а повторное концентрирование - диализом против 45-60%-ного раствора глицерина. Сущность способа заключается в следующем. Амилоризин экстрагируют буфером ацетата натрия рН 4,6 и экстракт подвергают термообработке при , проводят осаждение сульфатом аммония при 70 и 100% насыщения, осадок растворяют, диализируют и проводят депигментацию активированным углем, очистку нуклеазы S продолжают сорбцией на ДЭАЭ-целлюлозе в стационарном режиме в буфере ацетата аммония рН 5,2-5,6 и элюцией буферами повышенной ионной силы с удельной элёктропроводимостью (12-14)10 см.м , (23-30)10 см-м . Концентрируют раствор фильтрацией через мембрану Рипор с радиусом пор 50-150 мкм, хроматографируют на сефадексе Г-75, и конечный продукт стабилизируют . диализом против 45-60%-ного раствора глицерина. В результате отделяется основная масса пигмента и связанного с ним белка. Удельная активность при этом повьшается в 1,5-3 раза. Удаление ниэкомолекулярных белков позволяет более эффективно проводить хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и экономить материалы, в том числе ДЭАЭ-целлюлозу. На том же количестве ДЭАЭ-целлюлозы и сефадекса Г-75 можно осуществить разделение в 1,5-3 раза больших количеств фермента. Сорбцию 5д проводят на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,05-0,075 буфером ацетата аммония рН 5,2-5,6, что позволяет получить более хорошее отделение примесей РНКаз. Использование буфера ацетата аммония по сравнению с буфером ацетата натрия вызывает улучшенное разделение белковой смеси и способствует получению нуклеазы S высокого качества. Концентрирование образцов ультрафильтрацией обеспечивает дополнитель ную очистку (отделение низкомолекулярных веществ), при этом активность нуклеазы S сохраняется на 80-100% и из процесса очистки исключается диализ или разбавление раствора с целью получения раствора с более низкой электропроводностью, необходимое для сорбции на анионитах. Концентрирование образцов диализом против 45-50%-ного раствора глицерина позволяет обеспечить процесс концентрирования и стабилизацию препаратов нуклеазы S. Объем раствора нуклеазы S снижается в 2-3 раза. Упрощение процесса достигается включением в технологию очистки стадни, позволяющих улучщить контроль процесса и ускорить проведение отдельных стадий очистки. Замена стадий концентрирования на ДЭ-32-целлюлозы концентрированием на ультрафильтрах и диализом против глицерина, а также исключение хроматографии на сульфо-сефадексе позволяет сократить число стадий с 16 до 14. В результате получают препарат с удельной активностью 20.00070.000 ед/мг белка, выход 17%, практически не содержащий примеси неспецифических фосфатаз, фосфодиэстераз и экзонуклеаз, Пример 1. 160 г амилоризина экстрагируют 1,6 л 0,02 М буфера ацетата натрия, содержащим 0,05 М NaCl и 0,1 1 Z п . Осадок отделяют центрифугированием. Экстракт подвер гают термообработке, постепенно повышая температуру раствора до в водяной бане с температурой 75°С. К раствору добавляют сульфат аммония до насыщения 0,7 (800 г), переметивают и осадок отделяют центрифугированием. К центрифугату добавляют 320 г сульфата аммония (насыщение 1,0) и после формирования осадка . отделяют осадок центрифугированием, растворяют и проводят диализ против деминерализованной воды. К диализату добавляют 3% по объему активированного угля и перемешивают 30-40 мин при . Уголь удаляют фильтрацией через ватный порощок и разбавляют в 2 раза 0,05 М буферным раствором уксуснокислого аммония рН 5,2, содер жащего 0,1 мМ ионов цинка. К раствору добавляют ДЭАЭ-целлкшоз- (1 г на 100 мг белка) и перемешивают 20 мин. ДЭАЭ-целлюлозу отделяют фильтрацией, суспендируют в 0,05 М буфере ацетата аммония рН 5,2 и переносят в колонку (425 см). Колонку промывают раствором ацетата аммония рН 5,2 с удельной электропроводностью 12 1СГ см. м и фермент элюируют буферным раствором ацетата аммония рН 5,2, содержащего 0,1 мМ ионов цинка с удельной электропроводимостью 23 . Раствор нуклеазы S. фильтруют через мембрану Рипор-4 с радиусом пор 50-100 мкм до объема 20 мл и наносят на колонку с сефадексом Г-75 (4 хЮО см), уравновешенной буфером ацетата натрия рН 4,6, содержащего 0,1 мМ ионов цинка. Активные фракции объединяют и двухкратно диализируют при постоянном перемешивании при в течение 1 ч против 50%ного раствора глицерина (соотношение диализируемого раствора и диализирующего раствора - 1:10 по объему). Достигается 3-кратиое концентри-г рование раствора и стабилизация нуклеазы в растворе 50%-ного глицерина. В результате получают препарат нуклеаза S с активностью 10000 ед/мл, удельной активностью 30.000 ед/мг белка. Фермент при проверке вызывает расщепление суЛёрспиральной ДНК плазг МИДЫ pBR 322 и образование кольцевой и линейной формы ДНК. На электрофореграмме не наблюдаются размытые зоны продуктов расщепления ДНК, появление которых свидетельствует о наличии примесей эндонуклеаз. Выход составляет 17%. Препарат нуклеазы S также не содержит примесей неспецифических: фосфатазы и фосфодиэкстеразы (субстраты п-нитрофенилфосфат и кальциевая соль бис-п-нитрофенилфосфат). Активность нуклеазы S, определена по расщеплению ферментом денатурированной ДНК при рН 4,6. За единицу активности принимают количество фермента, которое катализирует гидолиз t Mr денатирурованной дезоксирибонуклеиновой кислоты за 1 мин при и рН 4,6. Пример 2. 0,7 кг амилоризина экстрагируют 7 л буфера ацетата натрия, проводят термообработку, высаливание сульфатом аммония, диализ и депигментацию, как в примере 1. К раствору, полученному при депигментации, добавляют ДЭАЭ-целлнщозу (волокнистую), уравновешенную 0,075 М буфером ацетата аммония рН 5,6, перемешивают и переносят в колонку (105(25 см), как описано в примере 1. Элюцню проводят буфером ацетата аммония, содержащим 0,1 мК ионов цинка и удельную электропроводимость 14x10 см.м и буфером с электропроводимостью ЗОЮ см. м. Активные фракции объединяют и ко центрируют уяьтрафильтрацией через мембрану Рипор-3 (радиус пор 100150 мкм) до объема 100 мл, наносят по порциям 20 мл на колонку с сефадексом и проводят :хррматографию, как описано в примере 1, Активные фракции объединяют и проводя концентрирование раствора диализом против 60%-ного глицерина, как описано в примере 1. В результате полу чают 200 мл раствора нуклеазы S. в 60%-ном растворе глицерина с активностью 21.000 ед/мл и удельной активностью 53.300 ед/мл. Выход сос тавляет 20% по активности. Пример 3. О,16 кг амилоризииа экстрагируют 1,6 л буфера ацетата натрия, проводят термообработку, высаливание сульфатом аммония, диализ и депигментацию, как в приме ре 1. К раствору, получейному 11ри депигментации, добавляют ДЭАЭ-целлю позу, уравновешенную 0,055 М буферо ацетата аммония рН 5,5, промьшают и переносят в колонку, как описано в примере 1. Элюируют колонку буфером ацетата аммония, содержащим 0,1 мМ ионы цинка, с удельной электропроводностью , 27«10см-М А1стивные фракции объединяют и прово дят ультрафильтр ацию и гель-хромато графию, как описано в примере 1. Рас вор нуклеазы S,, полученный при гел хромато1рафга1, концентрируют диализом против 50%-ного раствора глицер на в буфере. В результате получают 12 МП раствора S,- с активностью 31.000 ед/мл и удельной активностью 70.000 ед/мг белка. Выход по активности составляет 21%. Пример 4. 0,16 кг амилоризина экстрагируют 0,16 л буфера ацетата натрия и проводят термообработку, высаливание сульфатом аммония, диализ, депигментацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, ультрафильтрацшо и хроматографию на сефадексе Г-75, как в примере 1. Активные фракции, полученные при гель-фильтрации бО мл), диализируют двухкратно при постоянном перемешивании против 45%-ного раствора глицерина. В результате получают 28 мл раствори нуклеазы S с активностью 18.000 ед/мл, удельной активностью 27. 000 ед/мг и выходом 20%. При проведении хроматографии при концентрации солей ниже 0,05 М рН 5,2-5,6 наблюдается снижение стабильности фермента, а при концентрации вьше 0,1 М часть фермента при рН 5,2-5,6 не сорбируется. Значение рН 5,2-5,6 при хроматографии на ДЭАЭ-целЛюлозе обеспечивает высокую степень очистки, выход фермента и максимальное отделение примесных РНКаз. При рН 5,0 сн1 жается эффективность сорбции нуклеазы, -а при рН 5,9 и 7,0 в соответственно в 1,5 и 2,0 возрастает количество примеси РНКаз после хроматографии. Таким образом, изобретение обесДечивает получение препарата нуклеазы S высокого качества за счет увеличения его чистоты, а также упрощение способа за счет сокращения чис- ла стадий с 16 до 14 и облегчения проведения хроматографии и контроля за ней путем введения ступенчатой злюций фермента. Кроме того, способ позволяет получать фермент без использования импортной ДЭАЭ-целлюлозы фирмы Ватман. Себестоимость препарата составляет 0,18 р. за 1000 ед. активности по сравнению с 0,82 р. за препарат, выпускаемый на НПО Биохимреактив. Препарат по качеству соответствует препаратам фирмы Sigma, P-L Biochemicals и др.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕАЗЫ S из амшторизина, включакиций стадии экстракции, термообработки, фракционирования сульфатом аммония, диализа, хроматографии на диэтиламиноэтилцеллкшозе, 1сонцентрирования, гель-фильтрация на сефадексе Г-75 и повторного концентрирования, отличающийся тем, что, с целью увеличения чистоты целевого продукта и упрощения способа, после диализа раствор нуклеазы депигментируют Активированным углем, при хроматографии на диэтилa в нoэтилцeллк пe зe сорбцию осуществляют S 0,05-0, ацетата аммония с рН 5,2-5,6, адесорбцию осуществляют ацетатом аммония сначала с удельной электропроводностью