Способ получения белкового антигена фасциол Советский патент 1985 года по МПК A61K39/00 

1 Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, в частности проблеме получения антигенов из гел минтов, а именно из фасциол, паразитирующих в печени сельскохозяйственных животных и человека. Известен способ получения одного из антигенных компонентов фасциолбелкового антигена невысокого молек лярного .веса (27 500 дальтон-) комб наций методов гель-фильтрации, ионо обменной хроматографии и препаратив ного электрофореза ij . Недостатком данного способа является сложность (многоэтапность) процесса выделения и присутствие в препарате, кроме иммунологически активного материала, примесей други белков и полипептидов. Кроме того, такой процесс очистки сопровождается потерей антигенной активности вследствие распределения множественных форм антигена по разным фрак циям (антиген оказался не однородным веществом, а гетерогенной группой иммунологически близких, но раз личающихся по физико-химическим сво ствам компонентов). В результате ко нечный продукт представляет собой одну из фракций, куда попадает лишь часть исходной антигенной активност и он не свободен от сопутствующих примесей. Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения белкового антигена из гельминтов, в частности шистосом, включающий экстракцию антигена, очистку на сефадексе Г-200 и очистку методом аффинной хроматографии на агарозе, к которой в качестве лиганда присое динен фенилаланин, избирательно сорбирующий фермент из гетерогенной смеси веществ при рН 3,5-4,5 2J . При этом используется то обстоятель ство, что белковьй антиген шистосом является протеолитическим ферментом. Недостатком известного способа является проведение десорбции фермента либо снижением рН до 2-3, либо его повышением до 4,5-5,5.Для вьщеления низкомолекулярного белков го антигена фасциол, также оказавшийся протеиназой, такие условия десорбции неприемпемы, так как при слишком низких рН появляется опасность денатурации антигена, а 79 рекомендуемые более высокие его значения (рН 4,5-5,5) находятся в области, близкой к изоэлектрической точке антигена (), что также снижает его устойчивость. Кроме того, рекомендуемые значения рН ,не являются оптимальными для проведения иммунологических реакций. Наличие предварительного этапа выделения фермента на сефадексе Г-200 усложняет процесс очистки. Цель изобретения - повьш1ение степени очистки и предотвращение потерь белкового антигена фасциол. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения белкового антигена фасциол, включающему экстрагирование антигенов из гельминтов и их очистку методом аффинной хроматографии с сорбцией белкового антигена на связанном с фенилаланином нерастворимом комплексе и отмыванием несорбируемых элементов экстракта с последующим его элюированием, в качестве нерастворимого комплекса используют CNBrактивированную сефарозу 4В, а сорбцию белкового антигена фасциол и отмывание несорбируемьк элементов экстракта проводят при рН 3,83,9, причем связавшийся с сорбентом антиген элюируют при рН 7,0-8,0. Пример 1. Для получения сорбента со сродством к антигену-протеиназа берут 7 г препарата CNBr-активированной сефарозы 4В, приготовленной в лабораторных условиях из нейтральной сефарозы 4В ( использовать коммерческий препарат активированной сефарозы), суспендируют его в 0,001 М HG1 и многократно промывают тем же раствором на стеклянном фильтре из расчета 200 мл/г. Полученную суспензию геля смешивают с 50 мг фенилаланина, предварительно растворенного в 10 мл 0,1 М NaHCO с добавлением 0,5 М NaCl(можно использовать и другой, не содержащий аминогрзттпы, щелочной буфер). Смесь инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре и при постоянном помешивании (нельзя использовать магнитную мешалку). За это время заканчивается ковалентное « связывание фенилаланина с нерастворимой матрицей. Контролем окончания реакции является поглощение гелем растворенного фенилаланина. регистрируемое спектрофотометричес по снижению оптической плотности раствора. После этого гель промывают добавлением раствора О, 1 М NaHCOj/0,5 М NaCl. Надосадочную жидкость декантируют и проводят бл кирование оставшихся активных груп добавлением 50 мл 0,1 М трис-НС1-б фера с рН 8 (можно использовать ра створ другого вещества, содержащего аминогруппы, например, этанол амина) . Смесь непрерывно перемешивают в течение 2 ч, затем гель переносят на стеклянный фильтр и про мывают щелочным (0,1 М НаНСОз/0,5 NaCl), а затем кислым буфером. В к честве кислого буфера используют смесь 0,1 М лимонной кислоты 0,2 М NajHPO и 0,5 М NaCl (рН 3,8). Мож но использовать ацетатный или другой буфер с близким рН. Для полного удаления примеси веществ, нековалентно связанных с гелем, проводят не менее пяти таких цикло промывания (присутствие в щелочных и кислых буферных растворах 0,5 М NaCl обязательно). Полученный продукт (8 мл сорбен имеющего в качестве лиганда фенилаланин) упаковывают в хроматографическую колонку (1 см х 20 см) и промывают рабочим буфером, содержащим 0,5 М NaCl (рН 3,8). В качестве образца для проведен аффинной хроматографии используют частично очищенный препарат низкомолекулярного белкового антигена, лученный из экстракта фасциол гель фильтрацией на сефадекс Г-100 (фракция с К 0,3-0,4). Аналогичный препарат можно получить на фадекс Г-75, Г-150, Г-200, на сефа розе 6В иди соответствующих гелях других фирм. Антиген переводят либ посредством диализа, либо -на колон с сефадексом Г-25 з рабочий буфер, содержащий 0,5 М NaCl (рН 3,8). 7 МП обработанного таким способ антигенного материала с титром 1:128 (по результатам иммунодиффузии) вносят в колонку, предварительно заполненную сорбентом., и элюируют рабочим буфером несорбируемые гелем примеси, присутствующие в препарате (хромопротеид кори невого цвета, обуславливающий окраску препарата и экстракта, 5 полипептидов и др.). Для полного 794 их удаления необходимо собрать не менее 20 фракций элюата объемами по 1,5 МП (фиг. 1, первый пик). Элюцию сорбцировавшегося на геле антигена-протеиназы проводят другим буферным раствором - 0,05 М трис-НС1/ 0,5 М NaCl с рН 8,2 (фиг. 1, второй пик). Можно использовать буфер другой природы с близкими значениями рН.. Фракции, злюируемьте в таких условиях проявляют антигенную и протеолитическую активность, имев- j шуюся в исходном препарате, в то время, как фракцииi соответствующие первому пику, такой активностью не обладают. Она может иметь здесь место лишь в случаях, когда величина хроматографируемого образца превышает емкость сорбента. Последнее на качество очистки антигена не отражается, а приводит лишь к излишним потерям. Для определения антигенной активности элюата в реакций иммунодиффузии кислые фракции, соответствующие первому пику, нейтрализовали прибавлением к каждой по 1 мл щелочного буфера. ,Тля сравнимости результатов иммунологического анализа к щелочным фракциям, соответствующим второму пику, также добавляли по 1 мл щелочного буфера. Результаты количественного иммунологического анализа исходного образца и полученных фракций представлены на фиг. 2. Фракции предварительно были объединены в два пула (соответственно пикам оптической плот нести), скондентрированы до объемов, примерно равных объему исходного образца и охарактеризованы в реакции иммунодиффузии с яомощью иммунной сыворотки кролика с экспериментальным фасциолезом (Д мес. после заражения). Реакцию проводили в агаровом геле, используя штамп семерка , в централь ную лунку которого помещали иммунную сыворотку, а в периферические антигены в различных титрах (цифры 1-32 обозначают кратность разведения антигена). Иммунологический анализ концентрированных пулов, раститрованных щелочным буфером, показал, что антигенная активность исходного образ- . ца и пула 11 примерно одинакова. ричем такая же иммунологическая геерргенность очищенр{ого ан игена

5

(пул 11), как и в исходном образце (2 полосы преципитации) свидетельствует о том, что в результате аффинной хроматографии множественные формы не теряются, а оказываются сосредоточенными вместе, тогда как другие (неактивные) компоненты исходного образца удаляются в составе фракций, соответствующих пику 1. Последнее подтверждается следующими данными. Разделение антигенног препарата в результате аффинной хроматографии на две основные фракции, соответствующие двум пикам на графике (фиг. 1), и сосредоточение специфической активности в одной из них свидетельствует об удалении из исходного препарата большого количества примесей (площадь первого пика, соответствующего неактив ным примесям, больше площади пика 1 соответствующего активному материалу) . При электрофоретическом анализ исходного препарата антигена и полученных после аффинной хромато- графии фракций (пулов t и Ц) показано, что пул П, обладающий антигенной и протеолитической активностью, гораздо менее гетерогенен, чем исходный препарат, и что многие компоненты исходного препарата (хромопротеид, мигрирующий при электро.форезе в виде одной, а иногда 2-3 коричневых полос, до 5 полипептидов, идентифицированных по их растворимости в трихлоруксусной и сульфосалициловой кислотах, и некоторые другие) попадают во фракцию 1.

П р и м е р 2. Приготовление сор бента для аффинной хроматографии проводят так же, как в примере 1, но в качестве образца используют не частично очищенный препарат низкомолекулярного белкового антигена, а неочищенный экстракт фасциол, содержащий, кроме антигена-протеиназы другие паразитарные антигены и массу самых различных примесей.

Для получения экстракта берут 5 г фасциол, добавляют 2,5 мл 0,2 М цитат-фосфатного (или другого) буфера с рН 3,9, гомогенизируют 5 мин в блендере с режущими лопастями при О - 4°С. Гомогенат центрифугируют 15 мин при 800Q об/мин. Получают около 5 мл экстракта с титром .антйгена протеинады 1:256.

796

Хроматографическую колонку (1 см X 20 см) заполняют 8 мл сорбента, приготовленного и обработанного таким же образом, как и в примере 1 и уравновеше.нную тем. же буфером с рН 3,9 (обязательно содержа(цим 0,5 М NaCl) и наносят на поверхность геля 4 мл экстракта. Антиген-протеиназя сорбируется в в геле и остается прочно с ним связанным, тогда как остальные компоненты экстракта, в том числе и высокомолекулярные белковые и небелковые антигены вымываются при пропускании через колонку 50 мл упомянутого буфера (фиг. 3, пик 1). Элюцию сорбировавшегося антигенапротеиназы проводят с помощью щелочного буфера (0,05 М трис-НС1/0,5М NaCl) с рН 8 (фиг. 3, пик 11).

Иммунологический и электрофоретический анализ фракций, соответствующих пику 11, показал такую же с.тепень очистки aнтигeнa-пpoтeинaзы как и в примере 1.

Таким образом, этап предварительной очистки антигена протеиназы на сефадексе не является обязательным и такая же эффективная о.чистка возможна непосредственно из экстракта фасциол.

П р и м е р 3. Более упрощенный вариант получения антигена состоит в том, что его очистку приводят не в колонке, а в объеме. Предварительную подготовку сорбента и образца проводят так же, как и в примере 1 и 2. Затем образец выливают в стакан с сорбентом и перемещивают 15 мин (нельзя использовать магнитную мешалку, разрушающую сорбент). Полученную суспензию переносят на воронку со стеклянным фильтром и промывают для удаления несорбируемых примесей, как обычно, кислым буфером с рН около 4. Промывают до тех пор, пока в филь.трате не исчезнет белок (пока оптическая плотность фильтрата при фотометрировании не приблизится к нулю). Фильтрат отбрасывают, а к гелю на фильтре добавляют щелочной буфер и вытекающий при этом фильтрат, содержащий десорбировавщийся антиген-протеиназу, собирают в подходящую емкость.

Такой способ не требует сложного оборудования,, но сопровождается несколько большим расходом буферов. 7 и антиген выходит более разбавленным, чем в колоночном варианте. П р и м е р 4. Подготовку образца, подлежащего хроматографии, его посадку на предварительно подготовленный сорбент при рН около 4 и удаление несорбируемого материала проводят так же, как и в примере 2 или 1. Однако сорбировавшийся на геле антиген-протеиназу элюируют не щелочным, а нейтральным буфером с рН 7. Заметной разницы в эффективности десорбции при этих условиях не наблюдается. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокоочище ньш,препарат низкомолекулярного бел кового антигена фасциол, причем несмотря на гетерогенность самого антигена, его множественные формы 79 не теряются в процессе очистки, а оказываются сосредоточенными вместе. Десорбция антигена при нейтральных или слабощелочных значениях рН позволяет не только сохранить его нативность, но и непосредственно использовать его для проведения иммунологических реакций, для которых такие условия являются наиболее оптимальными . Предла1гаемый способ является более простым по сравнению с известным, так как высокая степень очистки антигена может быть достигнута практически в один этап. Полученный антиген может быть использован в качестве диагностикума при фасциолозе сельскохозяйственных животных и человека.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО АЛТИГЕНА ФАСЦИОЛ, включающий экстрагирование антигенов из гельминтов и их очистку методом аффинной хроматографии с сорбцией белкового антигена на связанном с феншталанином нерастворимом комплексе и отмыванием несорбируемых элементов экстракта, с последующим его элюированием, о тличающийся тем, что,- с ) целью повышения степени очистки И предотвращения потери белкового антигена фасциол, в качестве нерастворимого комплекса используют CNBrактивированную сефарозу 4В, а сорбцию белкового антигена фасциол и отмьгеание несорбируемых элементов экстракта проводят при рН 3,8-3,9, причем связавшийся с сорбентом антиген элюируют при рН 7,0-8,0. СЛ СО СЛ со Л 20X tfO (рракции Фиг.(