Способ связывания глобулярных белков с проционовыми красителями Советский патент 1984 года по МПК G01N1/30 

Изобретение относится к способам химической модификации белковых молекул, а именно к способам окраски белков проционовыми красителями, и может быть использовано в биохимии, молекулярной биологии, клинико-экспериментальной медицине и биотехнологии.

Известен способ связывания глобулярных белков с проционовыми красителями путем инкубации водного раствора белка с красителем, заключающийся в том, что смесь окрашиваемого белка с проционовым красителем в водной среде инкубируют при перемешивании в условиях поддержания стабильной в течение всего процесса окрашивания активной кислотности в диапазоне рН 3,4-9,8 и при стабильной в течении всего процесса окрашивания температуре в диапазоне l,5-4l C, Инкубацию продолжают до 24 ч. Затем окрашенный белок выделяют от свободного красителя фильтращ1ей в колонке с сёфадексом С - 25 или-С-ЗО СЗОднако известньй способ не обеспечивает прочного (ковалентного) связывания молекул красителя с молекулами белка.

Целью изобретения является повышение прочности связывания красителя с белком.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу связывания глобулярных белков с проционовыми красителями путем инкубации водного раствора белка с Красителем, белок с красителем смешивают в молярйом соотношении 1:35-1:45, доводят рН смеси до 2,0-2,5, после инкубации проводят обратимое осаждение белка, далее белок растворяют и последовательно инкубируют при рН 6,8-7,0, а затем при рН 9,0-11,0 до максимального связывания белка с красителем.

I Пример. Окрашивание лактатдегидрогеназы (молекулярная масса 100000-135000, р I 4,5) проционовым красителем печатающим зеленым В. Навеску белка (20 мг) растворяют в 2 мл 0,15 М NaCl. Добавляют 4,8 мг красителя (молярное соотношение белок: краситель составляет 1:40). Смесь тщательно перемешивают. Посредством 0,2 H.HCI рН раствора доводят до 2,3, Раствор инкубируют при в течение 15 мин. Дпя высаливания белка доводят рН посредством 0,5 H.NaOH

до 7,0 и добавляют при тщательном перемешивании 0,3 г сульфата аммония Высоленный белок, содержащий нековалентно связанный краситель, отделяют центрифугированием при 4000 об/мин, 20 мин, .Белковый осадок вновь растворяют в 2 мл 0,13 М NaCl . ( рН 7,0). Раствор диализируют против 500 мл 0,15 М NaCl (рн 7,0), содержащих 150 мг исходного свободного красителя, в течение 2 ч для удаления остатков высаливающего агента, Дпя ковалентного связывания красителя диапизованный раствор белка инкубируют при рН 6,9, добавив в раствор 40 мг трис-буфера и концентрированной НС1 (данное значение рН соответствует рК имидазольнь1х групп гистидиновых остатков в составе- белка) . Раствор инкубирзпот при в течение 4 ч, а затем - пр комнатной температуре в течение 10 ч Дпя ковалентного связывания красителя по месту N-кондсвых аминогрупп и аминогрупп лизиновых остатков в составе белка в раствор добавляют еще 40 мг трис-буфера и несколько капель 0,2 н. до рН 10,0, Инкубируют этот раствор при комнатной температуре в течение 4 ч, а затем при в течение 24 ч, Дпя очистки окрашенного белка от свободного красителя раствор фильтруют через сефадекс G - 75 (колонка 40л1,0 см ), используя в качестве элюируницего расворителя 0,15 М NaCl(pH 10,0), и лиофилизируют. При троекратном воспроизведении данного опыта содержание ковалентного связанного красителя в бе

ке составляло в среднем 12,8% (в расчете на массу белка).

При спектрофотометрическом анализе растворов белков, окрашенных предлагаемым способом, в 0,15 М NaCl (рн 7,0) максимум поглощения, света белковыми растворами оказывается сдвинутым в длинноволновую область в сравнении с максимумом поглощения света растворами соответствующих свободных красителей. При фильтрации окрашенных белков через сефадекс G-100 или G-150 красители остаются связанными с белками. Остаются связанными с белками красители при дискэлектрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, причем электрофоретическая подвижность окрашенных белков (например, подвижность окрашенного проционом ярко-синим сывороточного альбуми на и его субфракций) практически не отличается от подвижности соответствующих неокрашенных белков, для выявления которых на фореграммах применяли обычную фиксацию и -окраску кума.сси ярко-синим G-250. При экстракции окрашенных предлагаемым способом белков диметилформамидом, этанолом или смесью пиридина, муравьиной кислоты и воды красителя остаются связанными с белками. При осуществлении связывания проционовых красителей с сывороточным альбумином по известному способу ij

путем инкубации смеси красителя и белка при рН 6,2 и температуре 20-4(Лс в течение 1-24 ч с последующей очисткой белка фильтрацией через сефадеке G-75, сывороточный альбумин пол- 20

ностью освобождается от связанного красителя, например, при электрофоретическом фракционировании в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить прочность связывания проционовых красителей с глобулярными белками, обеспечивая ковалентное связывание белков с красителями.

Белки, связанные с проционовыми красителями по предлагаемому спосоных белков в жтиопатогенезе пищевой идиосинкразии; изучения реакций антителообразования и рецепции антител; определения протеолитической

диагностического электрофореза с количественной оценкой получаемых белковых фракций без какой-либо фиксации и окраски фореграмм; оценки стерильности помещений, оборудования, инструментов и препаратов при использовании микроо{)ганизмов, содержащих меченые красителем белки или продукты гидролиза окрашенных белков, а также могут быть использованы для решения ряда задач по исследованию свойств белков в экспериментальной медицине и биологии. бу, могут оыть использованы в клинической медицине для изучения компартментализации и метаболизма белковых пщролизатов, вводимых в орга-. низм в составе препаратов для парентерального питания, плазмозамещающих и дезинтоксикационных растворов; оценки эффективности и надежности пoлyпpoницae a lx мембран, используемых при гемодиализе; оценки эффективности лечебного элект }офореза фер1ментов (злектроэнзимотерапия); оценки проницаемости кишечной стенки по отношению к белкам и продуктам их гидролиза с оценкой роли экзогенактивности ферментов, проведения

СПОСОБ СВЯЗЫВАНИЯ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ С ПРОЦИОНОВЫМИ КРАСИТЕЛЯМИ путем инкубации водного раствора белка с красителем, отличающийся тем, что, с целью повышения прочности связывания, белок с красителем смешивают в молярном соотношении 1:35 - 1:45, доводят рН смеси до 2,0 - 2,5, после инкубации проводят обратимое осаждение белка, далее белок растворяют и последовательно инкубируют при рН 6,8-7,0, а затем при рН 9,0-11,0 до максимального связывания белка с красителем.