Способ определения @ -субъединицы фактора роста нервов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/534 

Изобретение относится к анализу биологических материалов и может быть использовано для количественного определения Л-субъеднницп фактора роста нервов () в биологическом материале .

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Иммуноген - комплексную Лбрму ФРН получают из подчелюстных слюнных яе- лез половозрелых беспородных самцов г-г тгтей. с испольяорлннем методов гель- 6 1льтрл:;н . . ;:,-:;.;jr-ifJiTiov хроплтог л-- фии. Полученная комплексная форма ФГП представляет собой белок с молекуляр- 1 ной массой 140 кД, состоягрш из двух 0(-, У-, и одной р-субъединицы, несу.

t

щей биологическую активность. Аитите-. ла получают путем пролонгированной иммунизации новозеландских кроликов выделенной комплексной формой ФРН с добавлением полного адъюванта Орейнда (Difco CI JA) 3 раза с двухнедельным интервалом в дозе 1.5 мкг/кг, затем через 60-40 дней по 60 мкг/кг. Через 2,5-3 месяца от начала иммунизации отбирают у кроликов кровь для получения антнсыворотки.

А-субъедшшцу ФРН для проведения аффинной хроматографии выделяют ионообменной хромзтографисй. Иммобилизацию полученной субъединицы провидят на носителе CHBr-актипированноч сефарозе 4В (Pharnacia Шпещш). Отммвку I г CNBr-активиропанной- сефлрозы iR rtpono- Дят 20П мл 10- м НС1 на стеклянном

vj

ел

i...,.

фильтре. Через CNBr-активированную се- фароэу 4В быстро (30 с) пропускают 30 мл охлажденного бикарбонатного буфера (раствор 0,2 М NaMCOj, содержащий5 0,2 11 NaCl pH 8,5); суспендируют ее с 5 мг JJ-ФРН, находящегося в 15 мл этого же охлажденного буфера, и перемешивают с помощью встряхивателя .(Prened ПНР) в течение 2 ч. Избы-- -10 ток А-ФРН удаляют центрифугированием с последующей промывкой бикарбонатным буфером, оставшиеся активные группы инактивируют обработкой 0,1 М трис- НС1 рН 8,0 в течение 2 ч при встря- 15 хпвании. Далее отмывают й-ФРН-сефаро- зу 4В следующими растворами: 0,05 М трис-HCl рН 8,0, 1 М NaCl (200 мл); 0,05 М трис-HCl рН 8,0; 1 М NaCl 0,4%-нып холат натрия (Serva ФРГ) 20 (200 мл); 0,05 М трис-HCl рН 8,0; О,2.Н NaCl (200 мл); 0,5 М NaCl в 0,01 М НС1 рН 2,3 (200 мл); 0,05 М трис-HCl рН 8,0; 0,2 Н NaCl (200 мл).

Инкубацию 5 мл антнсывороткн к плексной форме ФРН с |3-ФРН-сефароэой 4В проводят в пробирке в течение 3 ч при комнатной температуре, перемешивая. Далее носитель отмыва:-: от неспецифически сорбированных белков до 30 тех пор, пока оптическая плотность () супернатанта не становится ниже 0,05. Содержимое пробирки переносят на стеклянный фильтр и промывают следующими растворами: 0,05 It35 трис-HCl рН 8,0; 1 Н NaCl (500 мл); 0,05 Н трис-HCl рН 8,0; 1 М NaCl, 0,42-ный холат натрия (300 мл); 0,05 М ацетатный буфер рН 5,0 (300 мл); 0,05 Н трис-HCl рН 7,5; 40 0,2 Н NaCl (300 мл); бидистиллирован- (200 мл). Суспензию помещают в центрифужную пробирку и центри- фугируют (3000 об/мин) на МРЧ-310

(ПНР) в течение 3 мин.45

i .

Элюцию молекул антител, адсорбированных на иммобилизованном лиганде проводят, используя раствор 0,01 М НС1 рН 2,3, содержащий 0,2-0,5 И NaCl.50 К осадку добавляют 5 мл охлажденного

раствора элюируюпего буфера. Содержи-, мое пробирки встряхивают на холоде в течение 15-20 мин. Су.-.пензига центрифугируют (ЗСПО об/мин, 3 мин). One- рацию получения элюата повторяют дважды. Затем концентрируют антитела к (i-ФРН (АТ|3-ФРН), нейтрализуют 1 Н NaOH до рН 7,0 и лиофнлизируют. Аффинный сорбент регенерируют 0,2 М NaCl в 0,05 И трис-HCl буфере, рН8,0.

Введение радиоактивной метки в аф- фннно очищенные антитела осуществляют следующим образом: 1 мг иодогена (1, 3,4,6-тетрахлоро-3«(,6о{-днфенил глу колурил) (Pierco CPIA) растворяют в 10 мл перегнанного хлороформа. Из полученного раствора отбирают аликво- ту 1,6 мл, которую доводят до 10 мл перегнанным хлороформом и перемешивают. В пробирку для радиоиодирования вносят 4 мкг иодогена в 250 мкл и удаляют растворитель под небольшим током инертного газа. Полученные пробирки хранят в морозильнике при -16°С в течение 2-3 месяцев.

В пробирку с 4 мкг нодогенл последовательно вносят 50 мкл Ма в 0,2 Н трис-HCl буфере рН 6,4 и 90 мкг АТ.А..ФРЦ , доводят инкубационную смесь до 250 мкл выпеуказа нным буферным раствором. Инкубируют при комнатной температуре 10 мин: Для отделения 2 1-АТр,.(ррн от продуктов радиоиоди- роваиия реакционную смесь хроматогра- фируют на колонке (0,9x60 см) с сефа- крилом S-200 (Pharnacia Швеция) или Toyperl HU-60 superfine (Toyoso- da Япония), уравновешенной в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,1%-нын бычий сывороточный альбумин. Элюат собирают по 0,5-0,7 мл в пробир ки содержащие 0,5 мл раствора 17-но- го бычьего сывороточного альбумина в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4.

.Удельная радиоактивность WS.I- АТо ррн составляет 4-6 мкКи/мкг. ТХУ- осаждаемая радиоактивность в среднем находится в пределах 88-95%.

В качестве сорбента антител (аффин но очищенных ) используют полистирол, например, в виде планшета (Flow Великобритания).

Смешивание антител и антигенов при проведении иммунохимической реакции производят следующим образом. Покрывают лунки полистнроловых планшетов . мкг АТц.фрц D 200 мкл 0,1 М трнс-НС буфера рН 7,5 и инкубируют в термостате в течение 2 ч при 37 С; блокируют остаточные белок-связывпющие участки полистирола (триткды промьтля лунки) 0,05 U фосфатнь М буферном раствором рН 7,4, содержащим 1%-ньп 1 бычин сывороточный пльбумин, 0,15 М NaCl 0,05% азид натрия (Serva ФРГ).(буфер для анализа); инкубируют (17 ч.

А°С) со стандартными растйорами А-ФРЧ

(0,1-1000 иг/мл) п .100 мкл буфера

для анализа или с образцами, тестируе170754П 6

Ктк видно из таблицы, элюцип раствором 0,2-0,5 М NaCl при рН 2,3 обес- печнпает увеличение количества полумыми на его присутствие. Отстают ченных ЛТр.фрН по срапненню с элюциеи ки буфером для анализа (трижды); инку- Раствором 0,1 М NaCl при рН 2,3 в 3,6

и 5,0 раз соответственно.

По сравнению с известным предлагаемый способ позволяет повысить чувстбируют П5 1-ЛТр.рц (100000 имп/мин на лунку) в 200 мкл буфера для анализа в течение А ч при 57°С; отмывают (трижды) буфером дли анализа. Затем Q лунки вырезают, помещают в пробирки для счета радиоактивности на гамма- счетчике (Tracer Analytic СПА). Содержание А-ФРН определяют по калибровочной кривой.15

Пример 1. Иммунизацию живот- них, введение радиоактивной метки (изотоп ) в антитела, проведение нммунохимическоп реакции и ее оценку осуществляют аналогично описанному. 20 При очистке ЛТ. аффинной хромато- графней элюцию проводят, используя раствор 0,1М NaCl в 0,01 М НС1, РН 2,3.

вительность определения ft-ФРН с 1нг/мл до 0,1 нг/мл.

Фо.рмула изобретения

Способ о пре деления }-субъединицы фактора -роста нервов ,. включающий им- Пример 2. Иммунизацию живот- 25 мунизацию животных иммуногеном, очистных, введение радиоактивной меткику антител, введение в них радиоактив- (изотоп 5I) в антитела, проведение нммунохпмичсском реакции и ее оценку

ной метки изотоп г5 I с помощью окислителя , иммобилизацию немеченых антител на твердую Фазу, проведение HMMVосуществляют согласно гфимеру 1. При

вительность определения ft-ФРН с 1нг/мл до 0,1 нг/мл.

Фо.рмула изобретения

Способ о пре деления }-субъединицы фактора -роста нервов ,. включающий им- мунизацию животных иммуногеном, очистку антител, введение в них радиоактив-

ной метки изотоп г5 I с помощью окислителя , иммобилизацию немеченых антител на твердую Фазу, проведение HMMV

Изобретение относится к анализу биологических материалов и может быт, использовано для количественного определения А-субъединицы фактора роста нервов в биологическом натериале. Цель изобретения заключается в. полипении чувствительности определения р субъединицы Лактора роста нервов (А-ФРН). Сущность изобретения состоит в том,, что определение проводят радиоимму- нологичееким способом, при этом животных иммунизируют комплексной.формой ФРН, очистку образовавшихся антител проводят на аффинном носителе с ко- валентно .связанного А-ФРН при помощи элюцин раствором, содержщим 0,2 - 0,5 М NaCl, рИ °.,3. Радиоактивную метку 25 I п штитела вводят с помощью и о доге «(а в виде твердом Аази, на которую сорбируют намеченные антитела, используют полистирол. По сравнению с прототипом способ позволяет повысить чувствительность определения А-ФРН с,1 до 0,1 нг/мл. 1 табл.

рчистке АНв.фри аффинной хроматографи- зо нохимической реакции путем смепивания eii элющпо проводят, используя раствор 0,2 М НаС1 в 0,01 И НС1, рН 2,3. П р и м е р 3. Иммунизацию животных, введение радиоактивной метки (изотоп 2-51) в антитела, проведение иммунохимическоп реакции и ее оценку осуществляют согласно примерам 1 и 2. При очистке ЛТп фр1( аффинной хромато- графией глюцню проводят, используя раствор 0,5 М NaCl в 0,01 М НС1, рН 2,3. Дальнейшее пов прение концентрации NaCl при элюции ЛТп „pH не приводит к увеличению выхода.

антигена с иммобилизованными и мечеными антителами, радиометрию и расчёт содержания А-субъедпннцы фактора роста нервов по калибровочной кривой,

35 о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве иммутюгсна животным вводят комплексную форму фактора роста нервов, очистку антител прово40 Дят на аффинном носителе с ковалентно связанной А-субъединицей фактора роста нервов при помощи элюции раствором, . содер}хащим 0,2-0,5 М NaCl, рН 2,3, в качестве окислителя при введении

40 Дят на аффинном носителе с ковалентно связанной А-субъединицей фактора рост нервов при помощи элюции раствором, . содер}хащим 0,2-0,5 М NaCl, рН 2,3, в качестве окислителя при введении

Количество ЛТп-три элюнрованных растворами, различапгд1мпся ионной си- 45 метки применяют нодоген, а в качестве лой при рН 2,3, приведены в таблице.твердой фазы используют полистирол.

нохимической реакции путем смепивания

антигена с иммобилизованными и мечеными антителами, радиометрию и расчёт содержания А-субъедпннцы фактора роста нервов по калибровочной кривой,

о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве иммутюгсна животным вводят комплексную форму фактора роста нервов, очистку антител провоДят на аффинном носителе с ковалентно связанной А-субъединицей фактора роста нервов при помощи элюции раствором, содер}хащим 0,2-0,5 М NaCl, рН 2,3, в качестве окислителя при введении

метки применяют нодоген, а в качестве твердой фазы используют полистирол.