Поставленная цель достигиоп-и iipcjuiaracMbiM способом ОТДСЛР1ГИЯ fwiierrropa гл.юкокортикоид ных гормонов печени крыс от гранскортина и транскортинподобных белков, заключающимся в том, что Ш1тозал печени крыс обрабатывают водным раствором соли лантана с последующей обработкой нолучеиного осадка этилендиамиитетрауксусной кислотой в три с-НС Й-буфе ре. Предпочтительно используют 0,05 М раствор соли лантана, эквимолярное количество этШёнДиаййнтётрауксусной кислоты и трис-НС буфер с рН 7.5. К отличительным признакам способа; относят ся: использование воднь1Х растворов солей ланТана и обработка полученного осадка зтилендиаминтетрауксуспой кислотой в трис-НС буфере. Полученный препарат содержит 85% от ) к&;п1Йч1ества рецептора. Описываемый способ позволяет получить рецептор более простым способом как в несвязанном состоянии так и в комплексе с гормоно с выходами 85 и 98%, сбОтветственно. Пример 1, Отделение свободного рецептора глюкокортикоидных гормонов печени крыс от транскортипа и транскортинподобных белков с использованием из(ЫОз)зК навеске печени адреналэктомированных крыс прибавляют раствор следующего состава: 0,02 М трис-НСб-буфер, рН 7,5, 0,001 М дитио треит, 10 об.% глицерина (в дальнейщем ТДГ-буфер) (из расчета 3 мл буфера на 1 г печени) и ткань гомогенизирует до получения однородной массь. Здесь и далее все операции проводят при 0-4°С. Цитозол-раствор цитоплазматических белков, содержащий рецептор глюкокортикоидных гормонов, получают, отбирая надосадочную фракцию после центрифугировани гомогеяата печени при 105000 О в течение 1ч. К 0,9 мл полученного цитозола приливают 0,1 мл 0,05 М водного раствора Ьа(ЫОз)з. После 5 мин инкубации помутневший цитозол центрифугируют при 10000 О в течение 10 MH Супернатант отбрасывают, а осадок, содержащий рецепюр, дважды промывают Небольшими порциями ТДГ-буфера и растворяют в 1 мл . 0,0005 М этиленднаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), приготовленной на ТДГ-буфере. Полученный препарат содержит 85% количества рецептора, находящегося в исходном цитозоле. Отсутствие в полученном препарате трансKoptHHa и тpaнcкopтинпoдoбныJf. белков было доказано при помади экспериментов, которые иллюстрирует чертеж. Кривая 1 -дексаметазонсвязывающая (обусловленная О-белком)активность супернатанта); кривая 2 - термостабильная (обусловленная - и В-белками) кг1ргиз к1С я)(,|нан)1ц;1Я активость супсриатант; : кривая 3 лексамстазонсвязывагощая активность осадка (Q-бслок); кривая 4-тсрмостабильная кортизолспязывающая активность осадка (А- и В-бслки). В серию пробирок, содержащих по 0,8 мл цитозола вносят по 0,1 мл раствора 1а(МОз)з до конечной концентрации, указанной по оси абсцисс. Пробы инкубируют 5 мин, центрифугу ют 10 мин при ЮОООр, после чего супернатант оставляют для дальнейшего анализа, а осадок растворяют в 1 мл 0,005 М ЭДТА в ТДГ-буфере. В супе.рнатанте и препарате, полученном после растворения осадков, -определяют содержание А-, В- и 0-белкс. При анализе содержания А-, В- и G-белков в полученных препаратах исходят из следующих данных: а)G-белок способен связывать как дексаметазон, так и кортизол. б)А- к В-белки связывают кортизол, но не связывают дексаметазон. в)Прогревание при 40°С в течение 20 мин полностью инактивирует Q-белок, не оказывая влияния на А- и В-белки. Исходя из этого, о наличии в препаратах С-белка судят по их дёксаметазонсвязующей активности. Наличие А- и В-белков определяют по кoptизoлcвязывaющeй активности после прогрева препаратов в течение 20 мин, при 40С.. Анализ стероидсвязывающих белков супернатанта. Каждую пробу супернатанта (1 мл) делят на две равные части (по 0,5 мл). В первой определяют дексаметазонсвязуюшую активность, обусловлешую 6белком. Вторая, после 20 мин прогрева при 40°С, служит для определения термостабильной кортизолсвязываюшей активности, обусловленной А- и В-белками. Определение стероидсвязывающей активности гфоводят методом твердофазной адсорбции с использ1овани1ем в качестве адсорбента угля, псясрытЬго дёкстраном. G этой целью аликвоты (по 0,25 мл) каждой из анализируемых беЛковых фракций инкубируют 2 ч с 2, мол1 Н-дексаметазона или Н-кортизола как без, так и с 5000-кратнь1М избь1ткрм аналогичного нерадиоактивного стероида. Стероиды прибавляют к белковым фракциям в виде осадков, полученных при выпаривании их растворов.в с ганических растворителях. Несвязанный стеровд удаляют прибавлением 1/2 объема суспензии покрьггог о дёкстраном (3,75 г активированного угля и 0,375 г дбкЬтрана-500 в 100 мл ). Пробы интенсивно перемешивают в. течение 5 мин, и сорбент осаждают центрифугированием 10 мин при 10000 р . В полученных таким образом препаратах измеряют радиоактив5I. ность, оНусловлеиную связанными с белком радиоактивными стероидами. Величину спецИфического связывания радиоактивного стероида определяют по разности величины связанной радиоактивности препаратов в отсутствие и при наличии 5000-кратного избытка )тветствующсго нераяиоактивного гормона. Радиоактивность проб измеряют в сиинтилляторе Брэя при помо1ци жиякостного сцинтил ляционного счетчика Ultrobeta-1210 фирмы LKB-Wallac. Анализ стероидсвязывающих белков осадка. Содержа ше А-, В-, к G-белков в препаратах полученных после растворения осадков в 1 мл ЭДТА и ТДГ-буфере, определяют по методике, описанной в предыдущем разделе. Как следует из, графика, при увеличении концентрации La (N03)3 в цитозоле до 0,0005 М дексаметазонсвязываюшая активность его (6-белок) начинает падать и полностью исчезает при концентрации Ьа(МОз)з 0,005 М и выше (кривая 1). Термостабильная кортизо связывающая активность А- и В-белки при этом не претерпевает изменений (кривая 2). Как,следует из анализа кривой 3, обработк осадка, содержащего G-белок, раствором ЭДТА позволяет перевести его в растворимое состряше с восстановлением 85% исходной активности. А--и В- белков, судя по фоновым значениям термостабильной кортизолсвяэывак)щей активности (кривая 4), препарат G-белка не содержит. Пример 2. Отделение рецептора в комплексе с Н-дексаметазоном от транскортина и транскортинподобных белков с использованием иа(МОз)зВ 10 мл цитозола печени, полученного как описано в примере 1, вносят 1Q моль Ндексаметазона. Полученную смесь инкубируют в течение 2 ч дпя образования комплексов дексаметазон-рецептор. Несвязанный с белком гормон удаляют прибавляя к пробе 5 мл суспе зий покрытого декстраном, угля (3,75 г активированного угля и 0,375 г декстрана-ЗОО в. 100 мл ТДГ-буфера).Пробу интенсивно перемешивают в течение 5 мин, и сорбе гт осаждаю центрифугированием в течение 10 мин при , 10000р. Осадок отбрасывают. Супернатант, содержащий G-белок в комплексе с -дексаметазоном, служит исходным материалом для обработки La(N03)3К 0,9 мл полученного препарата приливают 0,1 мл 0,05 М водного раствора Ьа(ЫОз)зОбразовавшийся осадок белка отделяют ОТ раствора центрифугированием и растворяют его в I мл ТДГ-буфера, содержащего 0,005 М ЭТДА. Полученный, препарат содержит 97-98% исходного G-белка в комплексе с дексаметазоном и не содержит А- и В-белков (по причине неосаждаемости их Ьа(МОз)з, как продемсдастрировано и примере 1). Формула изобретения 1. Способ отделения рецептора гяюкокорти-, кридных гормонов печени крыс от транскортина и транскортинподобных белков путем обработки цитозола печени крыс водным раствором соли с последующим отделением осадка, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве водногб раствора соли используют водный раствор соли лантана с последующе обработкой полученного осадка этилеидиаминтетрауксусной кислотой в трис-НСЙ-буфере. 2. Способ по п. , отличающийся тем, что используют 0,05 М водный раствор соли лаитана, эквимолярное количество тилендяаминтетрауксусной-кислоты и трис-НСб-буфер с Р.Н 7,5. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Kobtinsky М., Beato М., Kalini М., Feigelson Ph. Glgcocorticoid-binding Proteins of Rat Liver Cytosol II. Physical characterisation and properties of the binding protefvs, L.Biol. Cham. 1972, 247, 7897: 2. Beato M., Feigelson Ph. Glucocorticoid- binding proteins of Rat Liver Cytosol.. I.Separation and identification of the binding proteins, J. Btolog.Chem. 1972, 247N024, 7890.
ЮО
50
-1зПа(нОз}з,н1
--Х
Увеличение (сонцемтрации
.;-:- .
СОЛ и JJон/пана
