СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 1997 года по МПК A61K39/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства вирусных вакцин, в частности инактивированный гриппозной вакцины (ИГВ).

Элюатно-хроматографический и фильтрационно-хроматографический способы производства ИГВ (на основе аллантоисного сырья) широко известны. Первый, включающий сорбцию-элюцию вируса на формалинизированных куриных эритроцитах и гельхроматографию на модифицированном макропористом стекле, позволяет получать наиболее чистый препарат ИГВ из всех ныне существующих. При этом данный способ включает малотехнологичный в условиях производства этап сорбции-элюции на куриных эритроцитах [1,2]
Фильтрационно-хроматографический способ, основанный на сочетании методов концентрирующей ультрафильтрации и гельхроматографии на макропористом стекле, характеризуется большей экономичностью и технологичностью, но получаемая при этом вакцина уступает элюатной по чистоте: содержание аллантоисных примесей-овальбумина (ОА) и неовальбуминовых примесных антигенов (не-ОА) [3,4] Это объясняется тем, что не-ОА примесные антигены близки по размеру к вирусу гриппа и поэтому молекулярно-ситовыми, а в большинстве своем, и сорбционными методами не удается эффективно очистить вирус [5]
Сущность изобретения заключается в том, что гельфитрат вируса обрабатывают трипсином в концентрации 0,5-1,0% который избирательно расщепляет балластные белки, переводя их во фракцию низкомолекулярных соединений.

Примеры осуществления способа.

Пример 1. Вирус гриппа А/Виктория/1/88(HIN1) накапливают путем заражения 11-дневных куриных эмбрионов. В вируссодержащую аллантоисную жидкость вносят насыщенный 35% -ный раствор сульфата аммония до конечной концентрации 3,5% Смесь перемешивают и выдерживают при 4^oC в течение 16 ч, после чего удаляют осадок аллантоисных примесей через мембранный фильтр.

Далее вирусную суспензию концентрируют ультрафильтрацией на установке типа "Сартакон". Концентрированный вирусный материал очищают гельхроматографией на модифицированном макропористом стекле МПС-2000 ВГХ. Нагрузка на колонку составляла 20% скорость элюции 1 мл/см². мин. Вирусный пик собирают под контролем гемагглютинирующей активности.

Для дальнейшей очистки в вирусную суспензию вносят 25%-ный трипсин до конечной концентрации 1% Смесь выдерживают 30 мин при 37^oC и проводят вторую гельхроматографию в тех же условиях, что и первую. Полученный полуфабрикат вакцины инактивируют, стерилизуют и проводят оценку: биологических активностей препарата; эффективности очистки вакцины.

1) Гемагглютинирующую активность определяют в реакции гемагглютинации с 1% куриными эритроцитами (РГА).

Концентрацию гемагглютинина (ГА) оценивают методом радиальной иммунодиффузии (РИД).

Иммуногенную активность проверяют на беспородных белых мышах весом 14-16 г. Животным вводят внутрибрюшинно однократно и двукратно с интервалом в 14 дн по 0,3 мл и 0,6 мл препарата. Кровь берут на 10-14 сут после последней иммунизации, сыворотки проверяют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с гомологичным штаммом вируса гриппа.

2) Концентрацию ОА определяют в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с коммерческим препаратом.

Уровень неовальбуминовых аллантоисных примесей оценивают в РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом против пула неовальбуминовых компонентов незараженной аллантоисной жидкости (НАЖ). Также контролируют не-ОА антигены ракетным иммуноэлектофорезом (РИЭФ) с кроличьей гипериммунной сывороткой, используя в качестве стандарта пул не-ОА антигенов НАЖ, калиброванный по белку. С помощью РИЭФ удается установить выше или ниже предельно допустимой концентрации, равной 10 мкг/мл, находится уровень не-ОА антигенов в вакцине. Предельно допустимая концентрация была определена ранее в опытах по исследованию аллергенной значимости не-ОА примесей при многократной иммунизации животных гриппозной вакциной.

Данные свидетельствуют (табл. 1), что обработка суспензии трипсином перед второй гельхроматографией не влияет на гемагглютинирующую активность вируса и мягко воздействует на антигенную активность: снижение концентрации ГА 15% не превышает допустимые потери вируса при гельхроматографии.

Трипсин обладает наибольшей избирательностью действия, как свидетельствуют результаты в отношении аллантоисных примесей. Он эффективно расщепляет ОА и не-ОА антигены: концентрация ОА в полуфабрикате вакцины была на предельно допустимом уровне и равнялась 1 мкг/мл, титр не-ОА в РНГА составлял 1:1024, по данным РИЭФ этот уровень превышает предельно допустимую концентрацию не-ОА, равную 10 мкг/мл.

Под воздействием трипсина содержание ОА и не-ОА уменьшалось, соответственно, до 0,062 мкг/мл и 1:64 (5 мкг/мл не-ОА в РИЭФ), т.е. отмечено 16-кратное снижение уровня ОА и не-ОА антигенов.

Исследования иммуногенности готовых серий вакцины сер. 1-1 и сер. 1-2 (после внесения стабилизатора и проведения стерилизующей фильтрации) показало, что иммуногенная активность вакцины, полученной при участии трипсина (серия 1-2) была не ниже активности препарата, полученного без трипсина, среднегеометрический титр антител был одинаков и равнялся 1:138.

Наличие трипсина в очищенных препаратах контролировали следующим образом: 10 мкл каждого образца наносили на фотопленку. Появление "дырок" при расщеплении желатина свидетельствует о наличии протеолитической активности.

В контролируемых сериях 1-1 и 1-2 трипсин не обнаружен.

Таким образом, данный пример показывает, что трипсин в 16 раз снижает уровень аллантоисных примесей, что делает вакцинный препарат аллергенно безопасным при сохранении основных биологических активностей ИГВ.

Пример 2. Вирус гриппа А/Виктория/1/88(HIN1) накапливают, концентрируют и очищают как в примере 1. Доочистку производят трипсином в концентрации 0,5% Режимы второй гельхроматографии, инактивации, стерилизации, контроля активности и чистоты были как и в примере 1.

До обработки 0,5% трипсином полуфабрикат вакцины содержал: ОА 1 мкг/мл, не-ОА 1: 1024 (табл. 1), после обработки уровень ОА снизился в 8 раз (0625 мкг/мл) и не-ОА также в 8 раз (1:128), что соответствует 7 мкг/мл не-ОА в РИЭФ.

Вакцина, полученная с помощью 0,5%-ного трипсина (сер. 1-3), была более иммуногенна, чем контрольная вакцина (сер. 1-1): среднегеометрический титр антител при однократной иммунизации составлял, соответственно, 1:147 и 1: 138.

Следовательно, 0,5% концентрация трипсина, также как и 1% может эффективно применяться для очистки вирусной суспензии: уровень аллантоисных примесей снижается в 8 раз. Гемагглютинирующая и иммуногенная активности не уменьшались, снижение концентрации ГА (12%) было в пределах нормы.

Пример 3. Вирус гриппа А/Виктория/1/88(HIN1) накаливают, концентрируют и очищают как в примере 1. Последующая очистка осуществляется с помощью 0,3% трипсина.

До обработки трипсином полуфабрикат вакцины содержал ОА-1 мкг/мл, не-ОА
1: 1024 (табл. 1). После обработки наблюдали 4-кратное снижение концентрации ОА и 2-кратное не-ОА.

Иммуногенная активность была одинаковой в контрольной (сер. 1-1) и экспериментальной сериях (сер. 1-4).

Данный пример показывает, что применение 0,5%-ной концентрации трипсина снижает уровень аллантоисных примесей в 2-4 раза, при этом титр не-ОА составляет 1: 512 (10 мкг/мл), что является предельно допустимой концентрацией не-ОА в вакцине. Биологические характеристики вакцин обеих серий практически не отличались.

Пример 4. Вирус гриппа А/Виктория/1/88(HIN1) накапливают, концентрируют и очищают как в примере 1. Для последующей очистки используют трипсин в концентрации 0,1% Условия инактивации и стерилизации как и в примере 1.

При использовании 0,1% трипсина и последующей гельхроматографии наблюдается лишь 2-кратное снижение ОА, уровень не-ОА оставался без изменения. Оставались прежними и биологические активности вируса (табл. 1).

Этот пример показывает, что 0,1%-ная концентрация трипсина не достаточна для эффективной очистки вирусной суспензии, так как уровень аллантоисных примесей при такой обработке практически не изменяется.

Пример 5. Вирус гриппа А/Виктория/1/88(HIN1) накапливают, концентрируют и очищают как в примере 1. Для дополнительной очистки используют трипсин в концентрации 2% Условия второй гельхроматографии, инактивации и стерилизации были как и в примере 1.

До обработки 2% -ным трипсином полуфабрикат вакцины содержал: ОА 1 мкг/мл, не-ОА 1: 1024 (табл. 1), после обработки уровень ОА снизился в 32 раза (0,031 мкг/мл), не-ОА в 16 раз (5 мкг/мл в РИЭФ).

Отмечено 4-кратное снижение гемагглютинирующей активности, концентрация ГА уменьшилась на 56% иммуногенная активность была ниже, чем в предыдущих примерах и составляла 1:104.

Этот пример свидетельствует о том, что 2%-ный трипсин оказывает разрушающее действие как на аллантоисные примеси, так и на белки вириона.

Таким образом, в результате анализа представленных данных (примеры 1-5) удается выбрать оптимальные концентрации трипсина 0,5% и 1,0% применение которых для очистки вирусной суспензии позволяет существенно повысить чистоту готового вакцинного препарата.

Пример 6. Вирус гриппа N1B-25(H3N2) (репродуктивный рекомбинант) накаливают, концентрируют и очищают как в примере 1, включая доочистку трипсином в концентрации 1% Выбор данной концентрации объясняется тем, что на примере вируса А/Виктория/1/88 была продемонстрирована возможность эффективной очистки вирусной суспензии 1%-ным трипсином при отсутствии его отрицательного воздействия на вирион.

Уровень ОА и не-ОА в вирусной суспензии после гельхроматографической очистки (прототип, 1-я гельхроматография) составлял, соответственно, 0,5 мкг/мл и 1:1024 (табл. 2).

При обработке трипсином и последующей гельхроматографии титр не-ОА составил 1: 128, концентрация не-ОА в РИЭФ равнялась 6-7 мкг/мл, а концентрация ОА 0,062 мкг/мл, т.е. наблюдали 8-кратное снижение уровня не-ОА и 4-кратное снижение концентрации ОА.

Из результатов (табл. 2) следует, что обработка трипсином не влияет на гемагглютинирующую активность препарата, а также на концентрацию ГА. Исследования иммуногенной активности показали, что среднегеометрический титр антител для контрольного образца сер. 11-1 составил 1:128, а для экспериментальной серии (11-2) 1:138.

Этот пример свидетельствует о том, что данный метод доочистки вирусной суспензии посредством трипсина пригоден и для вируса гриппа с антигенной формулой H3N2.

Пример 7. Вирус гриппа B/Харьков/249/88 накапливают, концентрируют и очищают как в примере 1, включая доочистку трипсином в концентрации 1%
В вакцинном препарате, полученном с помощью трипсина (серия 111-2), уровень ОА и не-ОА антигенов был в 4 раза ниже, чем в контрольном образце (серия 111-1).

Гемагглютинирующий титр сравниваемых препаратов был одинаков (табл. 3), величины концентраций ГА различались в пределах ошибки метода (5%), иммуногенная активность экспериментального препарата (серия 111-2) была выше: среднегеометрический титр антител составил 1:275, в контрольной вакцине (серия 111-1) 1:169.

Этот пример еще раз демонстрирует эффективность применения трипсина для очистки как вируса гриппа А, так и вируса гриппа В.

Таким образом, дополнительная обработка 0,5-1,0% трипсином вирусной суспензии, приготовленной фильтрационно-хроматографическим способом, позволяет значительно повысить чистоту вакцинного препарата: уровень овальбумина и неовальбуминовых примесных антигенов снижается в 4-16 раз, что делает вакцину аллергенно безопасной.

При этом не отмечено значимых изменений гемагглютинирующей и антигенной (концентрации ГА) активностей вируса гриппа, а также иммуногенной.

Контроль остаточных количеств трипсина в вакцинах дал отрицательные результаты.

Применение фильтрационно-хроматографического способа с доочисткой вируса трипсином позволяет получить на 7-16% больше ИГВ, чем с использованием элюатно-хроматографической технологии (табл. 4). При этом сокращаются сроки процесса и снижается его трудоемкость, так как исключается малотехнологичный этап сорбции-элюции вируса на формализированных куриных эритроцитах.

Литература
1. Регламент производства N 173-89 на "Вакцину гриппозную хроматографическую инактивированную жидкую для детей".

2. Регламент производства N 234-90 на "Вакцину гриппозную хроматографическую инактивированную жидкую".

3. Фармакопейная статья ВФС 42-209ВС-89 на "Вакцину гриппозную хроматографическую инактивированную жидкую".

4. Полянская Н.Ю. Жебрун А.Б. Иммунохимический анализ процесса очистки вируса гриппа методами гельфильтрации и ультрафильтрации. Тр.НИИЭМ им. Пастера, т.58. Л.1982, 64-69 (прототип).

5. Розаева Н.Р. Полянская Н.Ю. Бичурина М.А. Барашкова Л.Н. Экспериментальное изучение побочного действия невирионных примесей в инактивированных гриппозных вакцинах. Тр.НИИЭМ им.Пастера, т.59. Л.1982, 121-125.

Использование: в медицинской промышленности и касается производства вирусных препаратов, в частности гриппозных вакцин. Сущность изобретения: гельфильтрат вируса обрабатывают трипсином в концентрации 0,5-1,0%, который избирательно расщепляет балластные белки (овальбумин и неовальбуминовые антигены), переводя их во фракцию низкомолекулярных соединений. Уровень аллантоисных примесей в вакцинном препарате снижается в 4-16 раз. 4 табл.

Способ получения инактивированной гриппозной вакцины, включающий ультрафильтрацию и гельхроматографию вируса гриппа, отличающийся тем, что полуфабрикат вакцины, полученный после гельхроматографии, обрабатывают трипсином в концентрации 0,5 1,0%