Штамм @ @ @ @ @ -1215-продуцент гидрогеназы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/02 C12N15/00 C12N1/01 

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, в частное ти к получению ферментов микробного происхождения. Известны термофильные продуценты гидрогеназ-Pseudomonas therinophilaj.ll, bacillus Sehegeiii 2. Для P.thermbphila оптимум температуры для гидрогеназы приходится на (активность фермента здесь достигает 0,22 Е), а при кратковременном нагревании до 80®С активность теряется полностью. Мембраносйязанная гидрогеназа В. schle gelii имеет оптимум температуры между 70 и 75°С и активность 26,IE. Е удельная активность, означающая

превращение 1 дМ субстрата за 1 мин/1 мг белка. ,

Наиболее близким к изобретению по активности и стабильности фермент является штамм мезофильной бактерии Thiocapsa roseopersicina, гидрогеназ которого имеет оптимум активности при и достигает 80 Е, причем активность фермента сохраняется чере 10 мин после нагревания при 70 С. Период полуинактивации в аэробных условиях при 37 С 80 ч з . Недостатками известных штаммов являются Невысокая активность гидроген-азы, ее способность окисляться кислородом воздуха и ее недостаточно высокая термостабильность. Целью изобретения является щтамм новой экстремально-термофильной облигатно автотрофной водородной бактерии Calderobacteriun hydrogenophllumnov.gen.nov.sp. ИНМИ-2-1215продуцента гиДрогеназы, обладающей высокой активностью Е) (коллекция Центрального музея промышленных микр организмов института ВНИИгенетика, ко.тшекционный номер ЦМПМ В-2695) , , отличающийся большой термостабильнос тью (температурный оптимум действия )и стабильностью к кислороду при выделении и хранении(период полуинактнвации при хранении 8 Д1. Препараты стабильной гидрогеназы С. Jiydrogenophilum могут быть исполь зованы в качестве катализатора в системах биоконверсии энергии для получения топливных электродов.. Штамм Calderobacterium hydrogeno philum Z-1215 выделен из альгобактериальных матов газогидротермаль ных источников Камчатки. Это экстремально-термофильная облигатно хемоавтотрофная водородная бактерия, 112

дирующая, в старых культурах светлокоричневая. Организм лучше растет при перемешивании жидкой среды. 5J аэробно окисляющая водород. Растет в жидкой минеральной среде в атмосфере газовой смеси, состоящей из 75% водорода, 15% кислорода и 10% углекислого газа. Культурально-морфологическиепризнаки: клетки штамма2 1215 представляют собой грамотрицательные неподвижные палочки размером 0,350,5x2,0-3,0 мкм. Деление клеток происходит септированием, организм спор не образует. На агаризованной минеральной среде дает мелкие округлые блестящие серевато-белые колонии. Лучше растет в жидкой культуре. Суспензия клеток серо-белая, опалесОптичем в стационарных условиях мальная температура роста 75-78 С. Нижний предел развития клеток организма отмечен при 50с-, верхний предел при 82 С. Сохраняет жизнеспособность при 90 С в течение часа. Продолжительную инкубацию при 90 С и более высйкой температуре не вьщерживает. Для выращивания C.hydrogenophilum Z-1215 используют минеральную среду Шлегеля с вдвое уменьшенным содержанием фосфатов. Состав среды (конечные концентрации) г/лЦ 2; ,75; NagHPO -KH-O 4,5; MgS04 0,2; СаС1„ 0,02; Fe(NH.i.)C, НсО, 0,012.1 ь i t В среду добавляют микроэлементы 2 мл/л. Смесь микроэлементов Хоагланда на 200 мл , мг: 22,8; CaCl2-6H20 8,0; CuSO -SHjO 0,8; МпС,7HjO 0,8 ZhSOj7H26 1,76: iji-iuu.2H20 5: NajMoO 2H O 5: NiClj 0,8. Физиолого-биохимические признаки. Облигатиый автотроф, т.е. растет исключительно за счет аэробного окисления водорода. Органические велцества культурой не используются, Р факторах роста не нуждается. В качестве единственного источника азота штамм Z-1215 использует солй аммония, нитраты, хуже мочевину. Нитрит не использует, способность к фиксаций молекулярного азота не обнаружена. Отмечается чувствительность к антибиотикам - пенициллину и рифампицину. Пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и рифампицин 10 мкг/мл полностью ингибируют развитие организма. При выращивании в жидкой минерал ной среде в атмосфере смеси водорода, кислорода и углекислого газа максимальная .удельная скорость рост клетокдостигает 0,4 ч, время генерации 2ч. Штамм C.hydrogenophilum Z-1215 для получения из него термостабильной и оксистабильной гидрогеназы выращивают на жидкой среде Шлегеля атмосфере газовой смеси из водорода кислорода и углекислоты (75:15:10) при оптимальной температуре роста 76 С в ферментере АК-З- (скорость вращения 750 об/мин). Культура является продуцентом высокоактивной и термостабильной гидрогеназы. Удельная активность гидрогеназы штамма Z-1215 составляет 200 |uM ми -- Максимальная активность гидрогеназы наблюдается в конце фазы линейного роста культуры(через .20 ч с начала культивирования. Температурньй оптимум активности гидрогена зы лежит в пределах 76-90°С. При температуре ниже 50 С гидрогеназная активность не обнаружена. Прогреваний препарата фермента в течение 1 ч при 60-90°не снижает активности и не приводит к коагуляции белков. Ценным свойством препаратов гидр геназы, продуцируемой предлагаемым организмом, является ее устойчивост к кислороду при хранении. Сравнител ное изучение изменений активности фермента при его хранении в атмосфе . ре водорода при и на воздухе в занороженном состоянии показало, что период полуинактивации в обоих случаях составляет 8 дн, т.е. данны фермент оксистабилен. Пределы рН для .гидрогеназы Calde bacterium hydrogenophilum достаточн велики, она проявляет активность в пределах рН - 13., Максимум активности при рН7,0. Активность гидрогеназы определяют в бесклеточных экстрактах. Для получения бесклеточного экстракта осадок клеток суспендируют в 0,05 М фосфатном буфере рН 7 и разрушают 5 мин при в дезинтеграторе при частоте 22 кГцГ Неразрушенные клетки и оско ки клеток отделяют центрифугированием(2010, 30 мин, ). Полученную надосадочную жидкость использую для определения активности гидроген зы. Гидрогеназную активность опреде ляют спектрофотометрически с метиле новым синим- и бензилвиологеном в качестве акцепторов электронов. Реакцию ведут в трубках Тунберга в атмосфере водорода при 7бс. Атмосферу водорода создают многократным откачиванием под вакуумом и заполнением трубки газом. Реакционную смесь, содержащую 60 мМ триеНС1 7,4, 50 мМ метиленового синего или 20 мМ бензилвиологена в основном пространстве трубки и фермент (l мг белка)в боковом отростке, термостатируют. в течение 10 мин при температуре от 50 до 95 С. Реакцию начинают приливанием фермента из отростка и энергичйьм встряхиванием. Контрольный вариант не содержит переносчика электронов и заполняется аргоном. Общий объем реакционной среды 1,6 мл. Кинематические кривые поглощения Н снимшот в спектрофотометре Specord с термостатирующим устройством. Восстановление метиленового синего и бензилвиологена, катализируемое гидрогеназой, регистрируют при 600 им. Содержание белка определяют по Лоури. Ферментный препарат хранят под водородом при на воздухе при -5 С. Скорость реак-ции и активность гидрогеназы определяют по линейному участку кинетической кривой с использованием молярных коэффициентов экстинкции для метиленового синего 26, молв/сй и для бензилвиологена 7,55.10 моль/см Гидрогеназа(Е С 1.12.)-флавопротеиновый фермент, обладающий низким окислительно-восстановительным потенциалом(,42 В), катализирующий обратимую активацию молекулярного водорода и способный использовать акцепторы электоронов с широким диапазоном окислительновосстановительных потенциалов: метиЛвиологен, бензилвиологен, НАД, ФМН, ФАД,метиленовую синь, цитохром С, феррицианид и нитрат. Удельная активность гидрогеназы вьщеляемой из Caldeirobacterium hydrogenophi lum штамм Z 1215, возрастает по мере роста . Максимальная удельная активность фермента отмечается в конце линейной фазы роста. При переходе культуры на стационарную фазу удельная активность фермента снижается на 25% от максимальной . Пример. Культуру выращивают автотрофно в ферментере на 3 л загрузка 100% - жидкая среда 66%, .газовое питание - 34%). Используют минергшьиую среду Шпегеля, Посевной материал - 200 мл суспензии клеток, выращенных авто рофно в колбах при 75. Газовое питание для культуры подается из баллонов через систему редукторов. Скорость продувки газовой смесью, состоящей из 75% Н2, 15 % О и 10 % COg, 500 мл/мин. Ферментация идет при 76 С. Автотрофный рост штамма 2-1215 в этих условиях характеризуется 12-ти часовой фазой задержки роста и последующим быстрым развитием, которое заканчива ется за 10 ч т.е. за это время культура выходит на фазу стационарного, роста. Время выращивания в данном случае 10 ч. Удельная активность ферментного препарата гидрогеназы из клеток штамма Z -1215 к этому моменту культура на стадии стационарного роста) 150|иМмин мг Активность гвдрогеназы определяют спектрофотометрическим методом по скорости восстановления бензилвиологена в атмосфере водорода при 70 С в анаэробных термостатируеь1ых кюветах. При ме р2. Культуру выращивают по прда1еру 1. В конце фазы линейного роста(через 8 ч с начала роста и 20 ч с начала культивирования)опреде ляют активность фермента гидрогеназы по примеру 1. Удельная активность гидрогеназы из клеток Calderobacteri um hydrogenophilum Z-1215,200 (UM мин . Препараты стабильной гидрогеназы С.Ьудго§епорЫ1шп могут быть использованы в качестве катализатора в системах биоконверсии энергии для получения топливных электродов в электрохимических преобразователях. В лабораторных условиях исследована возможность создания водородного электрода биохимического топливного элемента с участием гидрогеназы из Thiocapsa rosepersicina. Малая эффективность системы связана с низкой активностью фермента(40 Е), иммобилизованного в полупроводниковых материалах. Новая экстремально-термофильная . водородная бактерия Calderobacterium hydrogenophilum по гидрогеназной активности значительно превосходит все известные штаммы бактерий, способных продуцировать этот фермент. Поэтому штамм 2-1215 этой водородной бактерии можно рассматривать как ценный и перспектйвнвлй продуцент высокостабильной гидрогеназы для использования ее в качестве электрокатализатора в системах биоконверсии энергии. Кроме использования в качестве продуцента гидрогеназы, штамм С.hydrogenophilum Z-1215 можно рассматривать как источник пищевого и кормового белка (,60% от сухого веса клеток)с высоким содержанием аминокислот (36%). Способность предлагаемого штамма расти при высокой температуре (70-75 с) почти полностью исключает возможность: заражения среды постоп ронней микрофлорой.

. ШТАММ CALDEROBACTERIUM HYDROGENOPHILUM NOV.GEN.NOV.SPI ИНМЙ-Z - 215 (коллекция Центрального музея промьшшенньп микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ В-2695) -ПРОДУБИТ ГИДРОГЕНАЗЫ. (Л