Способ количественного определения фибриногена в плазме крови Советский патент 1985 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике нарушений свертываемости крови.

Известен способ определения концентрации фибриногена в плазме крови путем высаливания сульфатом аммония с последукедим измедением коагулята фотокалориметрическим или спектрофотометрическим методом 1.

Однако данный способ не обеспечивает селективного определения фибриногена из-за частичного осаждения других белков плазмы.

Наиболее близким к изобретению по техничесаой сущности и достигаемому результату является способ количественного определения содержания фибриногена в плазме, включающий свертывание фибриногена естественным ферментом тромбином, который обладает специфическим воздействием только на фибриноген и Не коагулирует другие белки, с поСледукщим фотокалориметрическим определением скоагулированного белка после его гидролиза 2 .

Недостатками известного способа, являются невозможность определения ТОЙ части фибриногена, которая утратила способность свертываться тромбином, а также трудность сбора без потер) слабоконсолидированных сгустков, образующихся при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и других видах патологии.

Цель изобретения - повьшение точности способа.

Поставленная цель достигается тем что согласно способу количественного определения фибриногена в плазме крови, включающему свёртывание фибриногена плазмы коагулирующим агентом с последующим количественнь1м определением скоагулированного фибриногена, определяют как свертываемьй, так и несвертываемый тромбином фибриногены а в качестве коагулирзпмцего агента используют яд многочешуйчатой эфы

(Echis raultisguamatus).

-.-iПример 1. КО,2 мл цитратно плазмы добавляют 4,8 мл мединалового буфера (рН 7,4), инкубируют смесь при в течение 5 мин, затем добаляют 0,1 мл рабочего раствора iiiHoroчешуйчатой зфы (1-1(J -5.-10 мг/мл) перемешивают содержимое пробирки стеляной палочкой и инкубируют 10 мин

при . Затем сгусток, образовавшийся в пробирке, извлекают, промывают в холодном растворе NaCl, сушат, отжимая на фильтровальной бумаге, и переносят в пробирку с 0,2 мл 0,1М раствора КаОН. Пробирку помещаю на 10 мин в кипящую водяную баню до растворения сгустка, затем в .пробирк вводят 6 мл 12,5%-ного раствора и 1 мл 0,1М раствора CuSO , перемешивают 10 мин, добавляют 1 мл раствора Фолина-Чикалто, разбавленного 1:2 дистиллированной водой и чере 30. мин определяют оптическую плотнос раствора на фотоэлектрокалориметре с красным фильтром. По привой разведений очшг1енного фибриногена показатели оптической плотности переводят количество фибриногена, г/л.

Яд змеи эфы многочешуйчатой (Echis multisguamatus), обладая гемокоагулирующим действием, отличается от тромбина следующими свойствами: его действие не блокируется гепарином и комплексом антитромбин Ш-гепарин, он коагулирует так называемьй заблокированный или тромбинорезистетньй фибриноген, т.е. фибриноген, входящий в фибрин-мономерные комплексы.

Пример 2. Сравнительное определение концентрации фибриногена тромбином и ядом многочешуйчатой эфы при блокировании коагуляции гепарино

Исследования на смешанной нормальной плазме (источник фибриногена).

Реактивы: смешанная нормальная плазма с 3,5 г/л фибриногена; источник антитромбина Ш-дефибринированная плазма (плазма, проинкубированная пр 56°С и течение 5 мин); раствор тромбина активностью в 20-5 с; рабочий раствор яда; разведения гепарина 0,1-1,0 ед/мл. 1

Проводится параллельное определение концентрации фибриногена известным и предлагаемым способами при различных уровнях гепаринизации испытуемых образцов плазмы.

Результаты проведенных исследований представлены в табл. К

Из табл. 1 видно, что ни фоне гепаринизации количество фибриногена, свертьгоаеМого тромбином, прогрессивно снижается, начиная с концентрации гепарина 0,3-0,4 ед/мл, а при 0,6 ед/мл не определяется в -связи с полным блокированием свертывания. В

отличие от этого, при использовании в качестве коагулирущего агента япа Echis muktiseuamatus. гепаринизация не влияет на количественное определение фибриногена в тех дозах, которые полностью блокируют естественную коагуляцию.

Такиг образом, предлагаемый метод позволяет определять концентрацию фибриногена в плазме даже при очень интенсивной гепаринизации больных, дающей полную несвертьтаемость крови

Исследования на растворе очищенного фибриногена.

Реактивы: раствор очищенного фибриногена, содержащий 94% свертываемого белка (по Лоури) в концентрации 4,0 г/л; источник антитромбина Ш-дефибринированная плазма; раствор тромбина, активностью с; рабочий раствор яда эфы; разведения гепарина 0,1-1,0 ед/мл.

Параллельное определение концентрации фибриногена производится известным и предлагаемый способами при разных уровнях гепаринизации (табл. 2

Из табл. 2 видно, что при коагуляции тромбином гепарин вызывает уменьшение количества определяемого фибриногена, тогда как с помощью яда выявляется весь введенный в систему фибриноген (4,0 г/л). I

Пример 3. Сравнительное

определение содержания фибриногена при свертьшании тромбином (известным ,способом) и ядом змеи Echis multisguamatus (предлагаемым способом) у больных с синдромом-диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдромом).

У этих больных выявилось более или менее выраженное блокирование фибриногена в фибрин-мономерных комплексах, что устанавливалось определением продуктов деградации

фибриногена в плазме, а таЛже по положительным результатам этаноловог и протамин-сульфатного тестов. Конт{зольные исследования проводились на плазме здоровых людей. В двух опытнь группах было 35 больных, в контрольной группе - 20 здоровьгх людей. Первую опытную группу составили больные с ДВС-синдррмами в фазе гипокоагуляции (20 человек), во вторую опытную группу (15 человек) вопти больные с ДВС-синдромами с полной несвертываемостью крови.

Результаты проведенных исследоваНИИ представлены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что у здоровых людей определяется примерно одинаковое количество фибриногена при свертывании тромбином (известный метод) и ядом эфы (предлагаемый метод). В отличие от этого у больных с помощью яда эфы выявилось достоверно больше количество фибриногена, чем при свер тывании тромбином. После коагуляции тромбином и удаления образовавшихся сгустков при дополнительном введении яда Echis multisguamatus образовался второй сгусток из тромбинрезистентного фибриногена. В разных случаях количество такого заблокированного фибриногена составило в среднем 1,27-0,78 г/л, т.е. достигало значительных величин. При исследовании больных в фазе полной несвертываемкости тромбином вызвать коагуляцию плазмы не удавалось, а яд эфы вызывал формирование плотного консолидированного фибринового сгустка. Проведение этанолового теста после свертывания тромбином выявляло фибрин-мономерные комплексы у больны с ДВС-синдромом в 80% случаев. В отличие от этого, после свертывания ядом эфы этаноловый тест всегда отрицательный, что говорит об осаждени заблокированного фибриногена и фибрин-мономерных комплексов этим коагулирующим агентом.

П р и м е р 4. Практическое использование предлагаемого способа определения содержания фибриногена в плазме крови на больных.

Больная К.Н., 25 лет. Диагноз: беременность 29 недель, внутриутробная гибель плода, ДВС-синдром, маточное кровотечение несвертьшающейся кровью.

Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагу- ляционньй тест на 10-й мин 35 с: каолин-кефалиновое время свертывания 87 с (контроль 45 с); протромбиновое время 42 с (контроль 17); тромбиновое время 73 с (контроль 20 с); этаноловый тест - положительный.

Содержание фибриногена при коагуляции тромбином составило 0,70 г/л.

Сделано заключение о выраженной гипофибриногенемии. Определение ядом эфы выявило 2,5 г/л фибриногена Таким образом, с помощью яда выяви$

.лось значительное количество фибриногена, не свертьшающегося тромбином )в связи с чем сделано заключение об отсутствии истинной гипофибриногенемии .и наличии в плазме большого количества заблокированного фибриногена, количество которого составило по подсчету 2,5 г/л - 0,7 г/л 1,8 г/л. Этаноловый тест после коагуляции тромбином оставался положительным, а после коагуляции ядом эфы становился отрицательным. Это позволило назначить адекватное лечение.

Больной К.С., 23 г. Диагноз; состояние после операции по поводу аневризмы ветви легочной артерии, ДВС-синдром, массивное кровотечение из послеоперационного шва., синяки на теле.

Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагуляционный тест на 10-й мин -.17 с; каолин-кефалиновое время свертывания 50 с (контроль 45 с); протромбиновое время 25 с (контроль 18 с); тромбиновое время 23 с (контроль 15 с); этаноловый тест положительный; при свертывании тромбином сформировался некачественньш мелкозернистьй сгусток, отжать и высушить которьш не удалось, ядом эфы определено 3,5 г/л фибриноГена. Сделан вывод о массивном внутрисосудистом свертывании крови с образованием фибрин-мономерных комплексов и бло- кированием в них фибриногена. А60026

Больной Р.А., 45 лет. Диагноз: ос.трый недифференцированньш лейкоз, ДВС-синдром, кровоизлияние в мозг с гемипарезом, желудочное кровотечение. 5 Синяки на теле, макрогематурия.

I

Результаты лабораторного иЬследования системы гемостаза: аутокоагуляционный тест на 10-й мин нет свертьшания; каолин-кефалиновое время свертывания - нет свертывания (контроль 50 с); проторомбиновое время 75 с (контроль 18 с); тромбиновое время 110 с (контроль 15 с);

15 этаноловый тест положительный; фибриноген при свертывании тромбином составил 0,5 г/л, при коагуляции ядом эфы 4,5 г/л. Количество заблокированного фибриногена составило

20. 4,5-0,5 4,0 г/л. Назначенное лечение , соответствующее фазе ДВС-синдрома.

Предложенный способ обеспечивает повышение точности определения концентрации фибриногена в плазме за счет коагуляции как всертываемого, так и несвертываемого тромбином (тромбино-резистентно го) фибриногенов, что имеет важное значение в диагностике массивного тромбоза, диссеминированного внутрисосудистог свертывания- крови, дифференциации этих состояний с гипергепаринемией, что весьма важно для диагностики и лечения.

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОГЕНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ, включающий свертьтание фибриногена плазмы коагулирующий агентом с последующим количественным определением скоагулированного фибриногена, отличающийся тем, что, с целью повьгазения точности способа, определяют как свертьгааемый, так и несвертьшаемый тромбином фибриногены, а в качестве коагулирующего агента используют яд многочешуйчатой эфы (Echis multisguamatus).

Скоагулированный тромбином 3,5 3,5 3,0 2,2 1,3 Скоагулировэнный ядом многочешуйчатой эфы 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 Нет свертывания 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5