Способ определения функциональной полноценности фибриногена Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 G01N33/86 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и касается способов диагностики нарушений свертывающей системы крови в клинике и эксперименте.

Известен способ определения функциональной полноценности фибриногена методом количественного его определения в сгустке плазмы, путем инкубации стабилизированной плазмы при добавлении CaCIa и тромбина (Рутберг Р.А., Лабораторное дело, 1961, №5, с.6). Однако, этот способ недостаточно специфичен, т.к. при наличии эндо- или экзогенного гепарина в плазме, а также при патологических состояниях, связанных с развитием ДВС-синдрома (например, активация фибринолиза) дает искаженные результаты, либо вообще не дает фиксированного результата.

Известен также способ определения типе рфи бри ногенолитичес кой активности крови, путем количественного определения фибриногена в цитратной плазме в присутствии ингибитора фибринолиза - раствора ЭАКК который при сравнении с контрольной пробой дает возможность определить степень диссоциации фибриногена в условиях резкой активации фибриногенолиза (А.С. № 1469468, 1988) Однако, указанный способ не дает возможности количественного определения функциональной полноценности фибриногена в условиях гепаринизации плазмы крови различной этиологии, что является непременным условием проведения экспериментов по имплантации искусственного сердца с применением аппарата искусственного кровообращения, а также при лечении больных

XI

QS

ч

4 Ю (Л

с различной патологией, находящихся в клиническом состоянии.

Из известных, наиболее близким является способ определения функциональной полноценности фибриногена, путем определения фибриногена В с использованием протаминсульфатного теста (Lipinski В., Worowski К,, Thrombos. Diathes. Haemorrh., 1968, № 20, p. 44-49).

Принцип: Появление в плазме сгустка при добавлении к ней протаминсульфата говорит о наличии в этой плазме неполяризующихся (заблокированных) фибрин- мономерных комплексов. Возможность образования этих комплексов после забора крови предупреждается добавлением к цитрату натрия ЭАКК.

Способ принят нами в качестве прототипа. Однако этот способ недостаточно специфичен, т.к. позволяет лишь качественно определить наличие деградированного фибриногена при развитии ДВС-синдрома средней степени тяжести, крайние проявления (легкие и тяжелые) этого синдрома, в частности обратимые и необратимые нарушения функциональной полноценности фибриногена тест не улавливает, а также не работает в условиях гепаринизации.

Целью изобретения является повышение специфичности способа.

Поставленная цель достигается тем, что стабилизацию крови при заборе осуществляют 3,8%-ным раствором цитрата натрия, в опытную пробу с протаминсульфатом добавляют смесь тромбина и CaCIa, а в контрольную - ту же смесь без протаминсульфата, определение функциональной полноценности фибриногена осуществляют путем взвешивания сгустка фибриногена и в случае увеличения его веса по сравнению с контролем делают заключение об обрати- -мом нарушении его функциональной полноценности, связанной с гепаринизацией, в случае уменьшения веса сгустка - о частичном его нарушении, а в случае полного распада его на хлопья - о полном нарушении его функциональной полноценности.

Способ осуществляется следующим образом: кровь у экспериментального животного или больного забирают из вены, не сдавливая мягких тканей, силиконирован- ной иглой в силиконированную пробирку в 3,8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Центрифугируют при 1500 об/мин, в течение 7 мин для получения плазмы, Плазму отсасывают и через 10 мин от момента взятия крови из сосудистого русла проводят определение количества фибриногена в двух параллельных пробах, Фибриноген определяют следующим образом: в контрольную пробирку к 0,5 мл цит- ратной плазмы добавляют 0,1 мл 3%-ного хлористого кальция и 0,1 мл раствора тромбина, активностью 10 с. В опытную пробу к

5 такой же смеси добавляют 0,1 - 0,6 мг протаминсульфата (количество добавляемого протаминсульфата зависит от активности гепарина в плазме крови и колеблется от О, I до 0,6 мг на мл, из расчета 0,1 мг протамин10 сульфата на 1 ЕД активности гепарина). Обе пробирки ставят на водяную баню 37°С на 5-10 мин для свертывания фибриногена.

Получаемые сгустки фибрина пропорциональны исходному количеству фибрино15 гена. Следовательно, для получения количества фибриногена и выражения его в г/л получаемые сгустки фибрина быстро высушивают на фильтровальной бумаге, взвешивают на торсионных весах. Вес сгустка

0 умножается на 2, на коэффициент 22,2 и делят на 100. Проводят сравнение концентрации фибриногена в контрольной и в опытной пробе с добавлением протаминсульфата.

5При нормальной функциональной полноценности фибриногена концентрации фибриногена в контрольной и опытной пробах одинаковы. При увеличении концентрации фибриногена в опытной пробе с

0 добавлением протаминсульфата от 0 до 7,1 г/л делает вывод о частичной или полной блокаде фибриногена гепарином, т.е. обратимом нарушении его функциональной полноценности. При уменьшении концен5 трации фибриногена в опытной пробе с протаминсульфатом от 10,2 г/л до 0 по сравнению с контролем - о частичном нарушении функциональной полноценности фибриногена, а при рассыпании сгустка

0 фибриногена на хлопья, соответственно, о необратимом нарушении его функциональной полноценности.

Осуществление способа занимает 20 мин от момента взятия крови. По

5 предлагаемому способу и способу-прототипу проведено 33 исследования в условиях эксперимента. Сравнительная диагностическая информативность и прогностическая ценность предлагаемого способа по сравне0 нию со способом-прототипом значительно выше. Способ-прототип не позволяет дать оценки функциональной полноценности фибриногена в случаях крайних нарушений, а также при условии гепаринизации живо5 тного.

Пример 1. Теленок, 3-х месячного возраста, весом 86 кг. Эксперимент по имплантации искусственного сердца с использованием аппарата искусственного кровообращения. Исследования проводились на наркотизированном животном каждые 30 мин на фоне работы аппарата искусственного кровообращения, и через каждый час после отключения аппарата и нейтрализации гепарина протаминсульфатом. Способ осуществляется путем забора крови из вены, не сдавливая мягких тканей, силико- нированной иглой в пластмассовую пробирку: 4,5 мл крови и 0,5 мл 3,8%-ного цитрата натрия. Точно фиксируется время взятия крови: тот час пробирку центрифугируют при 1500 об/мин в течение 7 мин для получения плазмы. Затем в две пробирки помещают по 0,5 мл плазмы, в контрольную пробу добавляют 0,1 мл 3%-ного раствора хлористого кальция и 0,1 мл тромбина 10 с активности; в опытную пробу - ту же смесь и 0,01 мл 1%-ного раствора протамин- сульфата (0,1 мг). Обе пробирки ставят в водяную баню при 37°С на 5 - 10 мин. для свертывания фибриногена. После визуальной оценки полученные сгустки фибрина быстро высушивают на фильтровальной бумаге и взвешивают на торсионных весах. Вес сгустка умножают на 2, на коэффициент 22,2, согласно способу Рутберг, и делят на 100. Проводят сравнительную оценку концентрации фибриногена в контрольной и опытной пробах, Параллельно проводится определение растворимых фибрин мономеров по способу-прототипу. Дополнительно проводят определение спонтанного времени свертывания крови, определение активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) для выявления активности гепарина. При осуществлении заявляемого способа на фоне гепаринизации использовались различные концентрации протаминсульфата от 0,1 до 0,6 мг на 1 мл плазмы, в зависимости от активности гепарина из расчета 0,1 мг протаминсульфата на 1 ЕД активности гепарина в 1 мл плазмы.

Результаты эксперимента представлены в табл.1.

Заключение: Таким образом, использование заявляемого способа позволило на протяжении всего эксперимента проследить за количественным содержанием, сохранность функциональной полноценности фибриногена на фоне гепаринизации, а также за адекватной нейтрализацией гепарина протаминсульфатом.

П р и м е р 2. Теленок 3,5 месяцев, весом 83 кг. Клинически здоров. Эксперимент по имплантации искусственного желудочка сердца с использованием АИКа. Исследования в процессе эксперимента проводились на тех же этапах и с использованием способа-прототипа и заявляемого способа по методике, описанной в предыдущем примере. Результаты исследований приведены в табл.2.

Животное погибло через 2 ч после от5 ключения АИКа и нейтрализации гепарина протаминсульфатом от кровотечения, связанного с резким нарушением свертывающей системы крови. Эти нарушения не представлялось возможным скорригиро0 вать.

В этом случае использование заявляемого способа дало возможность выявить нарушения функциональной полноценности фибриногена у интактного животного, а

5 именно резко выраженную диссоциацию фибриногена с 6,6 г/л до 2,2 г/л при добавлении протаминсульфата. Никакой клинически выраженной патологии у теленка не выявилось.

0 В процессе эксперимента проявилось полное нарушение функциональной полноценности фибриногена, которое выявилось заявляемым способом при добавлении протаминсульфата ин витро, а затем было

5 спровоцировано ин витро при введении протаминсульфата для нейтрализации гепарина в организме теленка после отключения аппарата искусственного кровообращения. При проведении исследований спосо0 бом-прототипом были получены отрицательные результаты.

Заключение: Таким образом, заявляемый способ может служить прогностическим тестом при серьезных оперативных

5 вмешательствах, в частностей, операциях по трансплантации сердца и имплантации искусственного сердца, которые требуют использования аппаратов искусственного кровообращения, гепаринизации с

0 последующей нейтрализацией протаминсульфатом.

Нарушения функциональной полноценности фибриногена, выявленные по заявляемому способу следует использовать как

5 прогностический тест при отборе животных на эксперименты, включающие использование аппарата искусственного кровообращения.

П р и м е р 3. Предлагаемый способ

0 определения функциональной полноценности фибриногена был использован акже в клинике у больных реанимационного профиля.

Больная Е., 37 лет, история болезни

5 № 3378, поступила в реанимационное отделение с диагнозом сахарный диабет I типа. Гиперосмолярный некротический гипергли- кемический синдром, сепсис.

Состояние больной крайне тяжелое,

требующее интенсивной терапии. Для определения функциональной полноценности фибриногена плазмы крови у больной не реже одного раза в сутки проводили исследование плазмы крови в соответствии с вышеописанным способом, параллельно - по способу-прототипу Наиболее информативные показатели в данном клиническом примере выявлены на 3, 10, 15 и 20 сутки наблюдений.

Сравнение результатов, полученных при использовании описываемого способа и способа-прототипа, представлены в табл.3.

Определение функциональной полноценности фибриногена по предложенному способу соответствовало клинической кар- тмне заболевания. Резкое нарушение функциональной полноценности фибриногена (3 сутки) соответствовало крайне тяжелому состоянию больной частичное нарушение функциональной полноценности ф| 0рино- гена (10 сутки) и/или выявление фибриногена, заблокированного гепарином (15 сутки), демонстрируют тенденцию к восстановлению функциональной полноценности фибриногена, как прогностически положительный признак в течении заболевания. При восстановлении функциональной полноценности фибриногена (20 сутки) состояние больной оценивалось как средней степени тяжести при отсутствии рефрактерности к проводимой корригирующей терапии.

Определение комплексов растворимых фибрин-мономеров по способу-прототипу в случае грубых нарушений функциональной полноценности фибриногена (3 сутки) дало отрицательный результат Аналогичная картина наблюдалась на фоне гепаринизации больной.

Заключение1 Таким образом, предлага- емый Способ позволил выявить функциональную полноценность фибриногена в

условиях ее грубых нарушений, а также в случае проведения гепаринизации у больной. Повышение специфичности определения функциональной полноцёйнбсти

фибриногена с помощью предлагаемого способа позволили подобрать адекватную корргирующую терапию и определить прогноз заболевания как перспективный

Использование предлагаемого способа

определения функциональной полноценности фибриногена позволяет оптимизировать условия эксперимента, проводимого с использованием искусственного кровообращения, а в условиях клинического применения выявить наличие ДВС-синдрома на ранних стадиях его развития, провести адекватную коррекцию, которая позволит предотвратить грубую полиорганную недостаточность и сократить время пребывания

больного в реанимационном отделении

Формула изобретения Способ определения функциональной полноценности фибриногена путем взятия

крови со стабилизирующей смесью, центрифугирования, добавления в полученную плазму протаминсульфата, инкубации и регистрации образовавшегося сгустка, отличающийся тем, что, с целью повышения

специфичности, в плазму добавляют смесь 0,1 - 0,6 мг/мл протаминсульфата и 0,1 мл тромбина с активностью 10 с и 0,1 мл 3 %-но- го раствора хлористого кальция, в контрольную - ту же смесь без протаминсульфата,

после инкубации взвешивают образовавшийся сгусток и в случае увеличения его веса по сравнению с контрольной пробой делают заключение об обратимом нарушении его функциональной полноценности, в

случае уменьшении его веса - о частичном нарушении, а в случае образования хлопьев - о полном нарушении функциональной полноценности фибриногена

Таблица 1

Продолжение табл. 1

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и касается способа определения функциональной полноценности фибриногена. Целью изобретения является повышение специфичности способа. Способ осуществляют посредством забора крови со стабилизирующей смесью, центрифугирования, добавления в полученную плазму смеси 0,1 - 0,6 мг/мл протаминсуль- фата и 0,1 мл тромбина с активностью 10с и 0,1 мл 3%-ного раствора хлористого кальция, в контрольную плазму ту же смесь без протаминсульфата, взвешивания образовавшегося сгустка и в случае увеличения его веса по сравнению с контролем делают заключение об обратимом нарушении его фун- кциональной полноценности в случае уменьшения его веса - о частичном нарушении, а в случае образования хлопьев - о полном нарушении функциональной полноценности фибриногена. Положительный эффект заключается в возможности количественного измерения, в то время как в прототипе проводилась качественная оценка. 3 табл. СО с

АКИ - аппарат искусственного кровообращения; П.С. - протаминсульфат.

По способу - прототипу результаты всех параллельных исследований были отрицательными.

1На фоне наркоза

2Подключение АИКа

330 мин работы АИКа k1 ч работы АИКа

51,5ч работы АИКа

6Отключение от АИКа, введение П.С.

7Через 1 ч после отключения АИКа

8Через 2 ч после отключения АИКа

Таблица2

Отсутствие крмплек- 6,2 хлопья

сов растворимых

фибрин-мономеров

10

Выявляется наличие 4,0 2,2 растворимых комплексов фибрин-мономеров

Отсутствие комплексов 1,78 растворимых фибрин- мономеров

Отсутствие комплексов k,k Ц,Ь растворимых фибрин- мономеров

ТаблицаЗ

Резкое нарушение функциональной полноценности фибриногена, требуется корригирующая терапия

Частичное нарушение Функциональной полноценности фибриногена, необходимо продолжать специальную корригирующую терапию.

Выявляется фибриноген, частично заблокированный гепарином (гепаринотерапия)

Функциональная полноценность фибриногена восстановлена