Способ получения стрептокиназы Советский патент 1985 года по МПК C12N9/70 

Изобретение относится к технологии получения микробных ферментов и может быть использовано для получения препаратов стрептокиназы медици ского и вереринарного назначения. Цель изобретения - уменьшение расхода пищевого сырья и снижение себестоимости целевого продукта. Цель достигается тем, что соглас но способу получения стретокиназы в качестве продуцента используют штамм Streptococcus eguisimilis 921/18-77, продуцент культивируют на питательной среде, в которую дополнительно вводят гидролиэат казеи на, с содержанием амийного азота 90 . 220 нг %, а также двузамещенный фос форнокислый натрий и сернокислый натрий при сйотношении компонентов, мае.%: Глюкоза0,4-0,9 Двузамещенный форсфорнокислый натрий0,1-0,4 CepHOKHCJHirii магний 0,01-0,02 Бикарбонат калия 1,0-1,2 Гидролизат казеина с содержанием аминного азота 90-220 мг % Остальное После осаждения концентрат ферме та подвергают диализу против фосфат ного буферного раствора н сорбционной очистке на фосфате кальция. Пример 1. Производственный штамм Streptococcus eguisimilis 921/18-77 засевают на агар с 5 вес крови барана и помещают в термостат при 36°е на 18 ч. Затем, не допуска охлаждения культуры, ее .1вают с агара казеиновым бульоном и полученную взвесь гаьщерживают при той же температзфе в течение 6 ч, приго говляя таким образом посевной материал. Казеиновую питательную .среду для смыва и культивирования продуцента стрептокиназы готовят из панкреотического гидролизата казеина, содержащего 800 мг % аминного азота. Эт Гидролизат разводят, внося в 371 л апирогенной дистиллированной воды 89 л гидролизата, после чего кипятят в течение 15 мин, фильтруют через асбесто-целлюлозные пластины типа ФС-1 и стерилизуют при 116 С в течение 30 мин. После охлаждения до 36 С в разведенный гидролизат 92 добавляют при перемешивании стерильные ингредиенты: глюкозу, двузамещенный фосфорнокислый натрий, сернокислый магний н бикарбонат калия до .получения среды следующего состава, мас.%: Глюкоза Бикарбонат калия Двузамещенный фосфат натрия Сульфат магния Гидролизат казеина, разведенный до содержания аминного азота 142 мг % Остальное Посевной материал в объеме 40 л вводят в ферментер с 500 л приготовленной питательной среды. Культивирование осуществляют под контролем рН. Стадию культивирования осуществляют в течение 5,5 ,ч. За это время рН снижается до 6,8. Культуральную жидкость освобождают от микробной массы центрифугированием при факторе разделения F 4000. Получают осветленную культуральную жидкость в объеме 520 л с активностью стрептокиназы 11000 ед/мл и содержанием побочнь1х ферментов (стрептолизина) 128 ед/мл. Концентрацию водородных ионов доводят добавлением в осветленную культуральную жидкость ледяной уксусной кислоты до рН. 6,5, после чего производят осаждение стрептокиназы при температуре -7 С зтанолом из расчета концентрации последнего в смеси 42 об.%. Операцию первого осаждения проводят в течение 5 ч. Затем отделяют осадок центрифугированием при факF 1500 и температуторе разделения ре -5 С н течение 20 мин. Для извлечения стрептокиназы осадок растворяют в физиологическом растворе, забуференном до рН 7,8. При этом объем физиологического раствора берут равным 26 л. ( Во время выполнения операции первого осаждения рН при введении зтанола повышается до 6,9, а по истечении часа достигает ранее установленного уровня 6,5. Нераствориршееся в забуференном физиологическом растворе компоненты отделяют центрифугированием при F 1500 в течение 20 мин при комнатной температуре. 31 Далее производят второе осаждение стрептокиназы при рН 4,9 (т.е. в-изо электрической точке) и следующих режимных параметрах: количество этанола в смеси - 43 об. %; температура осаждения - минус 11°С; время осаждения - 2,5 ч. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при F 1500 и температуре -5 С в течение 20 мин. Для извлечения стрептокиназы осадок растворяют в 1,8 л 0,0158 М фосфатного буферного раствора. Нерастворившиеся компоненты удаляют. После вьтолнения данной операции получают 1,8 л концентрата, активность стрептокиназы в котором равна 241000 ед/мп, а стрептолизина - 512 ед/мл. Следовательно, выход стрептокиназы после второго осаждения составляет 241000x1i8xJ Of; -X ,( 11000x520x103 Концентрат вносят в целлофановые мешки (3 мешка по 600 мл) и диализуют в них против 100-кратного объема 0,0t58 М фосфатного буферного раствора в течение 3-х суток при температуре 612 С. В результате диализа стандартизируется солевой состав концентрата и происходит освобож дение от оставшихся солей питательной среды. Концентрат очищают от стрептолизи на и пигментирующих веществ сорбцией на фосфате кальция. Для проведения операции сорбции предварительно гото вят гель фосфата кальция путем смеши вания 450 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,2) с 225 мл 1 М раствора уксус нокислого кальция с последующей трехкратной oт ЯJlвкoй геля фосфата кальция 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,2). На образовавшийся гель нанрсят 1,8 л концентрата стрептокиназы и перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. После это го ферментный раствор отделяют центрифугированием в течение 20 мин при F 1500. В результате получают концентрат стрептокиназы в объеме 1,8 л с актив ностью 125000 ед/мл, свободный от стрептолизина и пигментирующих веществ. I Выход стрептокиназы после сорбци: онной очистки составляет 125000x1 jtBxlOi „,f.o. „„ 110000x520x10 00%-3,9%. 9 П р и М е р 2. Производственный штамм Streptococcus eguisimilis 921/18-7/ засевают на агар с 5 вес.% крови барана и помещают в термостат при температуре 37 С на 20 ч. Затем, не допуская охлаждения культуры, ее смывают с агара казеиновым бульоном и полученную взвесь выдерживают при той же температуре в течение 6ч, приготовляя таким образом посевной материал. Казеиновую питательную среду для смыва и культивирования продуцента стрептокиназы готовят из панкреатического гидролизата казеина, содержащего 900 мг % аминного азота. Этот гидролизат разводят, внося в 100 л апирогенной дистиллированной воды 10,3 л гидролизата, после чего кипятят в течение 15 мин, фильтруют через асбесто-целлюлозные пластины типа ФС-1 и стерилиззлот при 116 С в течение 30 мин. После охлаждения до 37 С в разведенный гидролизат казеина добавляют при перемешивании стерильные ингредиенты: глюкозу, двузамещенный фосфорнокислый натрий, сернокислый магний и бикарбонат калия до получения среды следующего состава, мас.%: Глюкоза0,9 Двузамещенный фосфат натрия0,3 Сульфат магния 0,015 Бикарбонат калия 1,2 Гидролизат казеина до содержания аминного азота 103 мг% Остальное Приготовленньй посевной материал в объеме 8 л ,вводят в ферментер с 112 я вьшгеуказанной питательной среды. Операцию культивирования продуцента осуществляют при 36 С в течение 5 ч в периодическом режиме под контролем рН. При этом, начиная со 2-го часа культивирования, осуществляют импульсное перемешивание микробной взвеси. За время культивирования происходит снижение рН до 6,3. Культуральную жидкость осветляют ентрифугированием при факторе разеления F 4500, после чего произвоят фильтрование ее сначала через сбестовую пластину Ф-300, а затем ерез миллипоровую мембрану с размеом пор 0,22 мкм. Получают ферментодержащий раствор с активностью стрептокиназы 7520 ед/мл, стрептопиназы - 128 ед/мл в объеме 110 л. Концентрацию водородных ионов в ферментном растворе доводят добавлением ледяной уксусной кислоты до 6,3, после чего производят первое осаждение стрептокиназы обработкой данного- раствора 40 об.% этанола при температзгре -8 С в течение Л ч. При введении этанола до выпеукаэанной концентрация его в смеси рН повышает ся до 6,7, а по истечении часа дости гает 6,4. Затем отделяют осадок центрифугированием смеси в течение 20 мин при F 1500 и температуре -5 С Дпя извлечения стрептокиназы осадок растворяют в 5 л 0,0158 М фосфатного буферного раствора. Нерастворившиеся компоненты удаляют. Далее производят второе осаждение стрептокиназы при рН Д,9, т.е. в изо электрйческой точке, при следующих режимных параметрах: количество этанола в смеси - 40 о6.%; температура дят-ельность второго рсаждения - 3 ч. Образо вавшийся осадок отделяют центрифугированием при F 1500 и температуре 5С в течение 20 НИН. Для извлечения стрептокиназы осадок растворяют в 0,4 л 0,0158М ; фосфатного буферного раствора. Нерастворивииеся компоненты удаляют. После выиопнения данной операции получают 0,4 л концентрата с актив;йостью стрептокшааы 430000 ед/мл, а стрептопиэина - 512 ед/мл. Поэтому выход стрептокинаэы после 2-го осаждеяия равев .« Кон1 ентрат вносят в целлофановый iMCfflOK и диализуют против 40 л М фосфатного буферного раствора в течение 3-х суток при температуре 6±2°С. Для проведения операции сорбционной очистки предварительно готовят гель фосфата кальция путем смешивания 100 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,2) с 50 мл 1 М раствора уксуснокислого кальция с последукмцей трехкратной отмьткой геля фосфата кальция 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,2). На образовавшийся гель фосфата кальция наносят 0,4 л концентрата стрептокиназы и перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. После этого ферментный раствор отделяют центрифугированием в течение 20 мин при F 1500. В результате получают концентрат стрептокиназы в объеме 0,4 л с активностью 196500 ед/мп, свободный от стрептолизина и пигментирующих веществ. Выход стрептвкиназы после сорбционной очистки составляет 12§50952г $101 1007 -9 52 7520x110x10 х10и% -9,Ь%. В табл. 1 доказано культивирование Streptococcus eguicimilis 921/18-77 в казеиновой питательной среде при различных режимных параметрах. В табл. 2 представлен выход стрептокиназы по стадиям технологического процесса Для установления оптимального режима получения стрептокиназы принимают во внимание не только количество фермента, накопленное на стадии культивирования, но учитывают также потери целевого продукта на последующих стадиях технологического процесса, которые, как представлено в табл.2 зависят от условий культивирования. Т а блица 1

СПОСОБ ПОЛЗГЧЕНИЯ СТРЕПТОКЙНА путем периодического культивирования продуцента - стрептококка групШ С в присутствии глокозы и бикарбоната калия с последующю{ отделением культуральной жидкости и двукратным о аждением целевого продукта эта«олом сначала при рН 6,3 - 6,9 и затем, в изозлектркческой точке, о т л и,ч а ю щ и и с я тем, что, с целью уменьшения расхода пищевого сырья и снижения себестоимости целевого продукта, в качестве продуцента используют Streptococcus eguisimilis 921/18-77, продуцент культивируют на питательной среде 8 которую дополнительно вводят гидролизат казеина с содержанием аю1нного азота 90-220 мг %, а также двузамещен1а1Й фосфорнокислый натрий и сернокислый магний при следукщем соотношении компонентов, мас.%: 0,4-0,9 Глюкоза Двузамещенный фос0,1-0,4 форнокислый натрий 0,01-0,02 Сернокислый магний 1.0-1,2 Бикарбонат калия (Л Гидролизат казеина с содержанием аминного азота 90-220 мг Z Остальное 2. Способ (ю п. 1, от л и ч а ющ и и с я тем« что после осаждення концентрат фермента подвергают диализу против фосфатного буферного р астBopai и сорбционной очистке на фосфа4ib те кал,ьцня. 1 4311 00

1аО 0,7 0,4 0,017 8,1 0,16

2150 0,5 0,2 0,010 7,8 0,40

3150 0,5 0,2 0,010 7,3 0,35

1760

10000

6390