Способ получения холестеролэстеразы Советский патент 1988 года по МПК C12N9/16 C12N9/16 C12R1/38 

со со ел

|

Изобретение относится к микробиологической промьппленности и касается способа получения фермента холесте™ ролэстеразы из микроорганизмов, ко- торый может быть использован в аналитических системах для диагностических целей в медицине о

: Цель изобретения - повьшение фер- |ментативной активности холестеролэсте-ю разы в культуральной жидкости и сокращение времени культивирования.

Сущность изобретения заключается в том, что культивирование микроорганизма Pseudomonas mendocina ЦМПМ 15 В-2173 осуществляют на оптимизированной жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, минеральные соли, ии- дуктор, в состав которой вводят в качестве источника азота -- нитрат натрия, а в качестве индуктора - кукурузное масло и соевую муку.

Активность полученной холестерол- эстеразы определяют электрохимическим методомJ включающим взаимодействие фермента с субстратом - хо- лестерололеатом в фосфатном буфере в присутствии холестеролоксидазы. Определение активности проводят в соответствии со следующей схемой последовательных реакций:

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касается способа получения холестеролэсте- разы из микроорганизмов, С целью по- вьшения активности целевого продукта и сокращения времени процесса продуцент холестеролэстеразы Pseudomo- nas mendocina ЦМПМ-В-2173 культивируют на оптимизированной питательной среде, в состав которой дополнительно введены семиводный сульфат магния, соевая мука, нитрат натрия и кукурузное масло при следующем соотношении компонентов в питательной среде, г/л: глюкоза 0,5-3,0 нитрат HaTpiuj 1,0- 3,0; фосфат калия двузамещенный 0,5- 2,5; сульфат магния семиводный 0,5- 0,8; хлористый калий 0,3-0,8; соевая мука 20,0-40,OJ кукурузное масло 2,0- 8,0; вода - остальное Преимуществом предложенного способа является повышение активности получаемой холестеролэстеразы в культуральной жидкости в 12 раз и сокращение времени культивирования продуцента в 2 раза по сравнению с известным способом 3 табЛо § 1(Л

„ ,Т1 г, холестеролзстераза Холестерололеат

Холестерин + Олеиновая кислота

„ ,,. холестеролоксвдаза „ . Холестерин +0 - Холестенон +

Об активности холестеролэстеразы судят по скорости увеличения концентрации HjOj. Электрохимическое окисление на платиновом электроде при 0,6 В относительно Ag/AgCl электрода сравнения генерирует анодный ток. Скорость увеличения анодного тока пропорциональна (скорости образвания HjOj,которая пропорциональна скорости гидролиза холестерололеата, Тово пропорциональна активности хо- лестеролэстеразы. Угол кинетической кривой отражает скорость гидролиза холестерололеата и тем самым активность холестеролэстеразы.

Максимальная активность холесте- ролэстеразы в среде культивирования достигается к 54-му ч роста и равна 135 ед/Ло После осаждения сульфатом аммония активность полученного фермента-сырца составляет 900 ед/л Полученный таким образом препарат холестеролэстеразы сохраняет активность в течение 1-2 мес при t-4 Со

Пример 1 о Лабораторный способ получения холестеролэстеразы пу- тем культивирования штамма Pseudomonas mendocina ЦМПМ В-2173о

Способ включает следующие этапы: поддерживание культуры в пробирках, приготовление посевного материала в пробирках,культивирование продуцента в колбах,осаждение холестеролзстеразы из культуральной жидкости, определение активности фермента.

Поддерживание культуры Pseudomonas mendocina ЦМШ В-2173 и приготовление посевного материала .

Культуру поддерживают на столбиках 0,5%-ного мясопептонного агара под 2-3 мл слоем стерильного вазелинового маслао В этих условиях продуцент при комнатной температуре может храниться без пересевов в течение нескольких лет Для повседневной работы бактерии высевают из-под вазелинового масла на столбики 0,5%-ного мясопептонного агара, на которых культура без пересевов может хранить :- ся при комнатной температуре до , 1 месо Для культивирования в колбах бактерии пересевают с рабочего столбика на скошенный мясопептонньгй агар Культуру продуцента выращивают в термостате при в течение 24 ч, затем ее смывают с агара жидкой питательной средой, на которой в даль нейшем проводят культивирование Полученная суспензия служит посевным материалом для выращивания продуцента холестеролэстеразы в колбах.

Продуцент культивируют в колбах на среде следующего состава, г/л:

Глюкоза3,0

мука

2,0

1,0

0,5

0,5

20,0

Остальное

Кукурузное

масло4,0

рН7,6

Для получения среды указанного состава отдельно готовят 6%-ный раствор глюкозы и 1%-ный раствор MgS04 . Эти растворы отдельно стерилизуют при 0,5 и 1,0 атм соответственно в течение 20 мин Параллельно го- товят 900 мл раствора, содержащего остальные компоненты в указанных соотношениях о С помощью 1 нораствора NaOH доводят рН приготовленной среды до 7,6, которую разливают в колбы емкостью 750 мл до 90 мл и стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин Непосредственно перед засевом в каждую колбу стерильно добавляют по 5 м раствора глюкозы и сернокислого маг- ния. Засев проводят, добавляя в каждую колбу по 3 мл суспензии 2А-часо- вой культуры PseudoTOonas mendocina ЦМШ В-2173„ Бактерии выращивают в условиях аэрации на круговой качалке (200 об/мин) при 27 С в течение 50- 60 ч„ Фильтрат полученной таким образом культуральной жидкости содержит холестеролэстеразу с активностью 135 ед/Ло

Осаждение холестеролзстеразы из среды культивированияо

Культуральную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при на центрифуге ЦВР-1 при 10000 об/мин в Te IeHHe 10 мин, Надосадоч- ную жидкость оставляют, а осадок удаляют К надосадочной жидкости порция

ми при постоянном перемешивании и температуре +4 С добавляют перекрис

таллизованный измельченный сульфат аммония до конечной концентрации 50% и оставляют стоять в холодильни- ке 1-2 ч при +5 С Появившийся осадок отделяют центрифугированием при тех же условиях Надосадочную жидкость удаляют Полученный осадок суспендируют в минимальном количестве 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,0, и проводят диализ против того же буфера в те- чение 20-24 ч

Определение активности холесте- ролэстеразыо

За единицу активности холестерол- эстеразы принимают количество фермен- .та, катализирующее отщепление от холестерололеата 1 мкмоль холестерина в мин

Для определения активности фермента применяют следующие растворы:

фосфатный буфер 0,05 М, рН 7,0;

субстрат - холестерололеат 0,1 М в 10%-ном Triton tlOO;

холестеролоксидаза - с активность 17 ед/мл;

азид натрия 0,1 М - для инактивации возможно присутствукяцей катализы;

исследуемая проба, разбавленная до активности 150 ед/л

В измерительную ячейку, содержащую 1 мл буферного раствора 1 вводят 0,05 мл раствора 2, 0,02 мл раствора 3, 0,02 мл раствора 4 Череэ 1-2 мин реакцию инициируют добавлением 0,1 мл раствора 5 Измеряют ток и проводят расчет активности по формуле

. 1,2 р -10 нА/ ед/мл

мин

1000

:

де нА/мин - изменение тока;

р - степень разбавления

исследуемой пробы; 10 - степень разбавления исследуемой пробы в ячейке;

1,2 - коэффициент, равный концентрации холестерина в мкМ, которая способствует изменению тока в ячейке на 1 нА /6/ Получают

35

1 2-10-8

Тооо

9,4 0,9, ед/мл.

0

с

Активность полученного препарата холестеролэстеразы равна 900 ед/л

Пример 2, Определение зависимости активности холестеролэстеразы (ХЭ) от источника азота, концентрации глюкозы и минеральных солей, природы индуктора и его концентрации.

I

Для определения зависимости активности холестеролэстеразы в культуральной жидкости от источника азота за основу берут среду следукяцего состава, г/л: соевая мука 20; глюкоза 3,0; 1,0; КС 0,5; М§804-7Цр 0,5 рН 7,6,

I

Зависимость активности холестеролзстеразы от источника азота следующая:

При всех указанных в таблице концентрациях глюкозы и минеральных солей обеспечивается активность полученной ХЭ в культуральной жидкости выше, чем по прототипу (15-60 вместо 1 ед/л).

Для определения зависимости активности холестеролэстераэы от природы индуктора за основу берут среду следующего состава, г/л: глюкоза 10,0- NaNO, 2,0 1,0; КС1 0,5 М, MgSO,-7H,jO 0,5; рН 7,6.

Полученные данные приведены в табл„2,

Таблица

Следь

Кукурузное масло,А

6,0

Продолжение табл.2

Оливковое.

наело,4 4 4,0

Подсолнечное

масло,4 4 4,0

Соевая мука,20 20 60

Соевая мука,

20+кукурузное масло 20+4 135

Соевая мука, 20+оливковое масло2.0+4 78

Соевая мука,

20+подсолнечное

масло20+4 65

Из таблицы видно,что более-высокий положительный эбфект достигается при использовании соевой муки в сочетании с кукурузным маслом (активность полученной ХЭ составляет 135 ед/л).

Для определения зависимости активности холестеролэстеразы в культу- рапьной жидкости от концентраций соевой муки и кукурузного масла за ос- нову берут среду следующего состава, г/л: соевая мука 20 глюкоза 3,0; NaNO, 2,0; К,НР04 1,0; НС1 0,5; MgSO 71ЦО 0,5; рН 7,6.

Данные установленной активности ХЭ приведены в таблице 3,

Таблица

Из таблицы видно, что оптимальными концентрациями соевой муки и кукурузного масла в среде культивирования Pseudomonas mendocina ЦМПМ В-2173 являются соевая мука 20-40 г/л кукурузное масло 2-8 г/ло

гт

Преимуществом предложенного способа является повышение активности получаемой холестеролэстеразы в кульРедактор ТоЛазоренко

Составитель Л.Борисова Техред м.Ходанич

Заказ 2468/27

Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

туральной жидкости в 12 раз и сокра-, щение времени культивирования продуцента Pseudonronas mendocina ЦМПМ В-2173 в 2 раза по сравнению с известным способом.

Формула изобретения

(

Способ получения холестеролэстеразы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Pseudomonas mendocina ЦМПМ В-2173 на питательной среде при рН 7-7,6, содержащей глюкозу, двузамещенный фосфат калия, источник азота, индуктор и воду, до максимального накопления фермента с последующим осаждением фермента из культуральной жид кости, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и сокращения време ни процесса, в питательную среДу дополнительно вносят семиводный сульфат магния и хлористый калий, а в качестве источника азота используют нитрат натрия, в качестве индуктора - соевую муку и кукурузное масло при следующем соотношении компонентов в питательной среде, г/л:

0,5-3,0 1,0-3,0

0,5-2,5

0,5-0,8

0,3-0,8 20-40

2-8 Остальное

Корректор Н.Король

Подписное