Способ выделения стрептолизина о,гиАлуРОНАТлиАзы,СТРЕпТОдОРНАзы иСТРЕпТОКиНАзы Советский патент 1981 года по МПК C12D13/10 

центрифуге и отбрасывают слив. Погибшие стрептококки промывают . 2 раза фосфатньом буфером по 250 мл с концентрацией 0,1 М, рН-8,0, При этом элюируются все продукты обмена веществ. Объединенные элюаты. центрифугируют до прозрачности, и осаждают сульфатом аммония из расчета 60 г на 100 мл раствора. Осадок растворяют в 50 мл 0,02 М раствора фосфат ного буфера (рН 8,0) и освобождают от сульфата диализом относительно, того же буфера. Этот раствор нанося на колонну 2,5«15 см с ДЭАЭ-агароэой,. которую приготовляют заранее промыванием колонны .1 л 0,5 н.раствора NaOH водой .и уравновешиванием 0,0.2 М и раствором фосфатного буфера (рН 8,0.) . Э.люируют с линейным градиентом, который состоит из 1 л 0,02 М раствора фосфатного буфера (рН 8,0) и 1 л смеси 0,02 М раствора фосфатного буфера с О,4 М раствором NaCE (рН 7,6). Затем элюируют примерно при 0,01 М NaCE стрептолизин; -при 0,05 М NaC8гиалуронатлиазу; приО,1 М Naceстрептокиназу и при 0,2 М NaC стрептодорназу. Активные фракции могут быть объединены. Все операции проводят при комнатной темпермуре, хроматографию - при .

После обработки кислотой и отделения центрифугированием погибших стрептококков в фильтрате культурыостается не более 50 ед/мл стрептокиназы (около 1-2%), менее 20 ед/мл стрептодорназы (около 2%), менее 1 ТЕ/мп гиалуронатлиазы 1%) и менее 20 МЕ/мл стрептолизина (около 10%), После вьщеления кокков активность стрептокиназы 80-85%; активность стрептодорназы 65%, активность гиалуронатлиазы и стрептолизина - 40%,

После хроматографической очистки на колонне активность,%: стрептокиназы 60, стрептодорназы 25 гиалуронатлиазы 20, стрептолизина 15.

Удельная активность составляет 40000 и 50000 МЕ/Мг для стрептокиназы, 2500 - 5000 МЕ/МГ у стрептолизина О, 400 ТЕ/мг гиалуронатлиазы и 8000-10000 ед, у стрептодорназ

Пример 2.5л стрептококковой культуры обрабатывают согласно примеру 1. После вымывания продукTOJ8 стрептококкового обмена из погибших кокков получают 500 мл раствора в 0,1 М растворе фосфатного буфера. Этот .раствор перемешивают с 15 г двуокиси кремния в течение 2 ч при комнатной температуре Стрептолизин О,, стрептодорназа и стрептокиназа адсорбируются, тогда как гиалуронатлиаза остается а( растворе и посде осаждения 300 г

сульфата аммония может быть очищена следующим образом.

Оставляют на ночь и отделяют на центрифуге. Растворяют в 10 мл воды и центрифугируют до прозрачJ ноге раствора. Затем удаляют сульфат диализом относительно 0,02 М раст:вора фосфатного буфера и наносят согласно примеру 1, на колонку 2,5.25 см, наполненную ДЭАЭ-агарозой

Q и хроматографируют. Стрептолиэин, стрептодорназу и стрептокиназу, адсорбированные на двуокиси кремния, выделяют перемешиванием в течение 20 мин в воде с рН 9,5-10,5 и очищают

согласно примеру 4, гиапуронатлйазу

получают с активностью 1200 ТЕ/мг,

Пример 3, Отделение гиалуронатлиазы от других продуктов обмена веществ из сырого фильтрата культуры осуществляют с помощью

0 двуокиси кремния. К 5 л отцентрифугированной стрептококковой культуры перемешивают 15 г высокодисперсной двуокиси кремния с рН 7,5 в течение 2 ч, Стрептолизин, стреп5 тодорназа или стреп-.окиназа, адсорбированные на двуокиси кремния, могут быть очищены согласно примеру 4, Гиалуронатлиазу после осаждения сульфатом аммония очищают согласно

n примеру 2, Получают стрептокиназу с активностью 60000-80000 ед/мг и стрептодорназу с активностью 1000020000 ед/мг.

Пример 4, Сырой концентрат

с выделяют согласно примеру 1 из 5 л стрептококковой культуры вымыванием погибших кокков 0,1 М раствором фосфатного буфера (рн 8,0) дважды по 250 мл. Затем. 450 мл раствора центрифугируют до прозрачного, доводят рН до 3,5 и осаждают продукт добавкой 45 г NaCB, После 30 мин разделения на центрифуге осадок растворяют в 100 мл воды с добавлением 1 н,раствора NaOH по каплям.

5 Нерастворимый осадок отбрасывают. К этому раствору добавляют 10 мл 0,5 М раствора и доводят рН до 6,9, При перемешивании и поддержании постоянного рй добавкой 1 н.

Q раствора NaOH продукт осаждают добавлением по каплям 5,0 мл 1 М раст,вора CaCB/3L« Перемешивают. 15 мин и в течение 45 мин отделяют цейтрифугированием. Кальцийфосфатный Осадок промывают 50 мл 0,02 М раствором фосфатного буфера (рН 8,0) .Затем. 1-40 мл объединенного раствора насыщают 38 мл сульфата аммония. Перемешивают 15 мин и дают 45 мин отстояться, а затем отделяют осадок

0 центрифугированием.

Осадок промывают 50 мл 22%-ным раствором сульфата аммония и выбрасывают, Центрифугат и промывную вощу. объединяют, получают 175 мл. Из

5 этогс) раствора отделяют стрептокинаэу

осаждаением при рН 7,0 и добавлением 45%-ного сульфата аммония от большей части стрептодорнаэы. Для этого контролируют рН и добавляют еще 77 м насыщенного раствора сульфат.а аммония. После 15 мин перемешивания и 45 мин отстаивания осадок отделяют центрифугированием, промывают 50 мл 50%-ным раствором сульфата аммония и затем растворяют в 20 мл воды, Этот раствор подвергают диализу относительно 0,02 М раствора фосфатного буфера с рН 8,0 и наносят аналогичным образом на подготовленную колонку согласно примеру 1. Элюируют аналогично, Получают примерно 50% исходного количества стрептокиназы. Из остатка осаждения содержащего 60% стрептодорназы,последнюю можно легко вьвделить, осаждая добавлением 20 г твердого сульфата аммония на 100 мл раствора (47 г на 235 мл). После 30 мин перемешивания и 60 мин отстаивания осадок отделяют на центрифуге.

Стрептодорназу растворяют в 0,02 М растворе фосфатного буфера (20 мл), подвергают диализу относительно того же буфера и наносят на колонку, наполненную ДЭАЭ-агароз Элюируют также с линейным градиентом между 0,0.2 раствором фосфата (рН 8,0) и . М фосфатом +0,4 М NaC6 (рН 7,6) . При применении штамма стрептококка получают три активные фракции, которые элюируют при концентрации поваренной соли около 0,02, 0,05 и 0,5 М. Последняя фракция содержит 90% всей активности стрептодорназы. Выход составляет 20%.

Активность очищенной стрептокиназы составляет 60000 -80000 ед/мг.

Предлагаемый способ позволяет вьщелить в едином технологическом -. процессе несколько продуктов обмена из культуры стрептококка С, используемых в -медицине.

Формула изобрет;ения

1. Способ выделения стрептолизина О, гиалуронатлиазы, стрептодорназы и стрептокиназы, заключающийся в том, что культуральную жидкость содержащую стрептококки, подкисляют до рН 3,0-4,0, осаждают стрептококки с адсорбированным на них целевым продуктом, далее целевой продукт, элюируют 0,1 М раствором фосфатного буфера при рН 7,5-9,5, затем осаждают его из элюата раствором сернокисд.ого аммония, повторно элюируют 0,02 М раствором фосфатного буфера, полученный элюат хроматографируют на ДЭАЭ-агарозе и выделяют-целевой продукт элюацией в линейном градиенте.

2; Способ, по п. 1, отличаю0щийся тем, что, с целью выделегия гиалуронатлиазы, полученный после элюирования 0,1 М раствором фосфатного буфера элюат разбавляют фосфатным буфером рН 6,0-7,0 в соотношении 1:1, до.бавляют двуокись кремния и перемешивают при рН 6,07,0, выпавший осадок отделяют, а.из кадосадочной жидкости осаждают целевой продукт сернокислым аммонием, осадок растворяют, диализуют против

0 0,02 М раствора фосфатного буфера и полученный диализат хроматографируют на ДЭАЭ-агарозе.

3. Способ по п. 1, отличающий с я тем, что, с целью выделения стрептокиназы и стрептодорназы, к полученному после элюирования 0,1 М раствором фосфатного буфера элюату добавляют 10%-ный раствор хлористого натрия, выпавший осадок раство0ряют, обрабатывают раствор фосфорнокислым кальадаем и вьщелйют целевой продукт осаждением сернокислым аммонием и хроматографией на ДЭАЭ-агарозе.