Способ получения монаколина @ ,обладающего антигиперхолестеримическим действием Советский патент 1985 года по МПК C12P7/00 C12P7/00 C12R1/00 

мер, продуцирующий монаколин К микроорганизм может быть йначале культивирован на подходящей .среде, а затем полученные микроорганизмы могут быть собраны и использованы для инокуляции и культивированы на другой культуральной среде для нарабатьгоания требуемого монаколина К; культуральные среды, используемые для размножения микроорганизма и дл нарабатывания минаколина К, могут быть идентичными или равными.

Может использоваться любая извес ная культуральная среда, пригодная для культивации грибов, при условии что она содержит необходимые питательные материалы, особенно источник усваиваемого углерода и источник усваиваемого азота. Примерами подходящих источников усваиваемого углерода являются глюкоза, мальтоза декстрин, крахмал, лактоза саха роза и глицерин, из которых предт почтительны для производства монак/лина К глюкоза, глицерин и крахмал. Примерами подходящих источников усваиваемого азота являются пептон, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, соевая мука, арахисовая мука, жидкость после замачивания кукурузы, рисовые отруби и неорганические источники азота, из которы предпочтителен пептон. При производстве монаколина К неорганическая соль и/или соль металла могут быть, если это необходимо, добавлены к культуральной среде. Кроме того, если требуется, может быть добавлено небольшое количество тяжелого металла.

Микроорганизм предпочтительно культивируют в аэробных условиях с использованием известных методов культивации, например, твердой культуры, встряхиваемой культуры или культуры в условиях аэрации и перемешивания. Микроорганизм растет в широком температурном диапазоне, например 7-40 С, но с точки зрения производства монаколина К более предпочтительна температура культивации 20-30 С. Во время культивации микроорганизма нарабатывание монаколина К может контролироваться отбором культурной 55 среды и измерением физиологической активности монаколина К вкультуральной среде с применением описанных тесТОВ. Культивация может быть затем продолженадо накопления в культуральной среде существенного количест монаколина К, после чего монаколин К может быть вьщелеи и извлечен из культурального бульона с помощью любой подходящей комбинации методик выделения, выбранньк с учетом его физических и.химических свойств. Например, возможно применение любого или всех нижеследующих методов выделния: экстракция раствора из культурального бульона гидрофильным растворителем (например, диэтиловым эфиром, этилацетатом, хлороформом или бензолом); экстракция организма гидрофильным растворителем (таким ка ацетон или спирт); концентрирование; растворение в более полярном растворителе (например, ацетон или спирт); удаление примесей менее полярным растворителем (таким как петролейный эфир или гексан); гель-фильтрация через колонку с таким материалом как сефадекс; абсорбционная хроматография с использованием активированного угля или силикагеля, и т.п. Путем применения подходящей комбинации , этих методов требуемый монаколин К может быть выделен из культурального бульона в виде чистого вещества.

Монаколин К, в том виде как он выделен из -культурального бульона Monascus ruber штамм 1005, характе ризуется следующими свойствами (серия А) .

Цвет и форма: бесцветные .кристаллы.

Точка плавления: 157-159 С (с разложением).

Элементарный анализ, %: С 71,56; Н 8,85; О 19,59.

Молекулярная масса: 404 (по данным масс-спектрометрии).

Молекулярная формула: С is у

УФ-спектр поглощения (метанол): максимумы на 232, 238 и 246 нм.

ИК-Спектр поглощения (KB г).

ЯМР-спектр (протонный 60 МГц; в дейтерированном хлороформе с использованием тетраметилсилина в качестве внутреннего стандарта). ЯМР-спектр ( С; в дейтерированном метаноле). Растворимость: растворим в низших спиртах (например, метаноле, этаноле и пропаноле), ацетоне, хлороформе. этилацетате и бензоле. Нерастворим в петролейном эфире и гексане. Удельное вращение: + 307,6 (, метанол). Тонкослойная хроматография; Rf 0,47 Г№ 5715 Кизельгель ( силикагель (фирма Мерк энд Ко.), проявление смесью 4:1 метиленхлори ацетон, детектирование в виде УФ-по глощаемой массы, 50% (об./об.) серн кислота (цвет от бледно-красного до красновато-коричневого проявляется при нагревании) или иодом}. Пример 1. Monascus ruber штамм 1005 инокулируют на жидкую культуральную среду, содержащую 6 об.% глюкозы , 2,5 об.% пептона, 0,5 об.% жидкости после замачивания кукурузы и 0,5 .вес./об.% хлорида аммония. Культивацию продолжают в аэробных условиях при 28°С в течени 10 сут. Результирующий фильтрат (5 культурального бульона доводят до рН 3 добавлением 6 н хлористоводородной кислоты, а затем экстрагирую равным объемом этилацетата. Растворитель из экстракта отгоняют при пониженном давлении и результирующи остаток растворяют в 100 мл бензола Нерастворимое вещество отфильтровывают. Фильтрат дважды промывают, кажды раз 100 мл 5 вес./об.% водным раствором бикарбоната натрия. Затем к промытому фильтрату добавляют 100 м 0,2 н цодного раствора гидроокиси натрия и смесь перемешивают при комнатной температуре. После подтве ждения исчезнования монаколина К из бензольного слоя данными ТСХ отделя водный слой. рН водного слоя затем доводят до рН-3 добавлением 6 н хлористоводородной кислоты и резуль тирующий раствор дважды экстрагирую каждый раз 100 мл этилацетата. Экст ракт упаривают до сухого остатка пр пониженном давлении, получая 260 мг масла. Монаколин К способен снижать уровень содержания холестерина в крови и Печени. Пример 2. Снижение уровня содержания холестерина в крови и печени крыс. Используют крыс породы ВистарИмa ити, каждая особь весом около 300 г. Испытания проводят на группа крыс, каждая группа насчитывает по 5 животных. Каждому животному знгтривенно делают инъекцию 300 мг/кг Тритона (товарное наименование для материала, повьшающего уровень содержания холестерина в крови) при одновременном введении 10 мг/кг монаколина К либо перорально, либо внутрибрюшинно. Спустя 20 ч после перорального введения или 14 ч после внутрибрюшинного введения крыс умерщвляют путем обескровливания, кровь н печень собирают и обычными методами определяют уровень содержания холестерина в них. В результате установлено, что уровень содержания холестерина в крови ниже по сравнению с контрольной группой животных, которой вводят лишь Тритон WR-1339, на 22,4% в случае перорального введения и на 23,9% в случае внутрибрюшинного введения. Уровень содержания холестет рина в печени снижен на 16,7% у животных, которым монаколин К вводят перорально. Пример 3. Сниясение уровня содержания холестерина в крови у кроликов. Используют подопытных животных кроликов, имеющих вес тела 2,7 2,9 кг. Каждому кролику перорально вводят 1 мг/кг монаколина К дважды в сутки (утром и вечером) непрерывно в течение 5 сут. Перед введением и на третий и пятый день после введения собирают кровь из ушной вены и определяют содержание холестерина в сыворотке крови. В результате получено, что содержание холестерина на третий и пятый день после введения монаколина К на 15 и 29% соответственно ниже уровня до введения минаколина К. Монаколин К обеспечивает 50%-ное ингибирование биосинтеза холестерина при концентрации 0,002 мкг/мл с помощью эксперимента, в котором уксусную кислоту вводят в реакцию с ферментом из печени крыс. Обнаружено, что Монаколин К ингибирует ИМ С-6оА редуктазу, которая является регулирующим скорость ферментом биосинтеза холестерина, и что он конкурентно ингибирует субстратную НМ G-CoA и имеет К, - значение, равное 5, М. К - значение представляет собой константу ингибирования и, более конкретно, константу диссоциации комплекса фермент-ингибитор. Эту величину получают умножением концентраций 711580 фермента и ингибитора с делением на концентрацию комплекса ферментингибитор. В дополнение к высокоценному5 ингибиторному эффекту в отношении биосинтеза холестерина монаколин К характеризуется крайне низкой токсичностью. Так, острая пероральная токсичность (LDjo ) монаколина К дляЮ 488 мьппей составляет 1 г/кг веса тела или еще большую величину, Монаколин К может быть введен перорально или парэнтерально в виде капсул, таблеток, препаратов для инъекций шти в виде любого другого известного состава, Таким образом получают препарат монаколин К, обладающий антигипер-. холестеримическим действием.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНАКОЛЙНА К,, ОБЛДЦАЮЛСЕГО АНТИПШЕРХОЛЕСТЕРИМИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ общей формулы НО. о заключающийся в том, что Monascus ruber 1005 (FERM - Р4822) выращиваютв питательной среде, cor держащей источник азота, углерода и минеральные соли, в аэробных условиях при 20г35лС ,с. последующим вьзделением целевого продукта из,купьтуральной жидкости. со CZ ел 00