Способ получения полисахарида Советский патент 1982 года по МПК C12P19/04 

Изобретение относится к технике лучения полисахаридов путем культив рования продуцирующих его микроорга низмов и может быть использовано в качестве добавки в корма, носителя для лекарств и косметических вещест или промышленных химикатов, предпочтительно смазок для бурения. Известен способ получения полиса харида путем культивирования продуцирующих его микроорганизмов рода Pseudomonas на питательной среде в УСЛОВИЯХ аэрации, содержащей метанол в качестве единственного источн ка углерода, источники азота, фосфора и другие необходимые минеральные соли, с последующим выделением полисахарида ГП Однако получаемый по известному способу полисахарид недостаточно активен. Цель изобретения - увеличение активности полисахарида. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения полисахарида путем культивирования продуцирующих его микррорганизмов рода Pseudomonas на питательной среде в условиях аэрации, содержащей метанол в качестве единственного источника углерода, источники азота, фосфора и другие необходимые минеральные соли, с последующим выделением полисахарида, из рода Pseudomonas используют штамм Pseudomonas pclysaccharogenes М-30, при этом культивирование ведут при рН 6,5-7,5 и 28-30 С в течение А8-72 ч. Способ осуществляют следующим бразом. Штамм Pseudomonas polysaccharoenes М-30 культивируют на питаельной среде в условиях аэрации, одержащей метанол в качестве единственного источника углерода, источ39НИКИ азота, фосфора и другие необходимые минеральные соли. I Новый штамм Pseudonranas polysaccharogenes М-30выделен из образцов почвы в районе Шитосума, префектуры Ибараки, в Японии 1 мая 1975 г. Штамм хранится в техническом исследовательском институте микробиологической промышленности (Агенство промышленной науки и технологии Министерства международной торговли и промышленности Японии) в коллекции микроорганизмов под № , этот новый штамм хранится также в американской типовой коллекции культур США под неизвестным номером . Морфологические свойства нового штамма Pseudonranas polysaccharogenes М-30. Рассматривают неподвижный культуральный бульон в среде метанояьного бульона (О,5% по объему) при kQ ч. Форма и размер клетки - бациллиформа 0,,5 X 1,0-2,5 мкм. Колония обычно одиночная, частич но сдвоенная. Неподвижный с одним побегом, спо не имеется, грамм/окраска отрицател ная, кислотная прочность отрицатель ная . Характеристика роста в различных средах. В бульонной культуре развивается В бульонной жидкой неподвижной культ ре при 30°С в течение 5 дней сильно развитие, образования пленки не име ется, осадок образуется, мутность образуется. На бульон-агаровой культуре при 30°С в течение 10 дней сильное раз витие, форма волокнистая, поверхнос гладкая, периферия волокнистая, про зрачность мутная, окраска оранжевая. На пластичной культуре бульонагара при .в течение 21 дня форма неправильная, периферия волок нистая, поверхность плоская, гладка На бульон-агаровой колотой культуре при 30° в течение 7 дней разви тие по поверхности и вдоль верхнего надреза. На бульон-метанольнрй (0,5 по объему) агаровой пластинчатой культуре при 30 в течение 30 дней форма круглая, периферия волокнистая. форма поднимающейся поверхности плоская, поверхность гладкая, окраска оранжевая. На метанольной синтетической жидкой среде, содержащей 0,5 г нитрита калия,1 г кислого фосфата калия, 0,5 г семигйдрата сульфата ма1- ния, 10 мг семигйдрата сульфата железа, 0,1 г дрожжевого экстракта и 1 об. метанола, растворенного в 1 л чистой воды, рН 7.0 при в течение 5 дней развитие обильное, имеется осадок, мутность, образования пленки не наблюдается. Физиологические свойства. Восстановление нитрата положительное, денитрификация отрицательная. Опыт на метил-красный МР отрицательный, опыт на Р (Фогс-Проскауер) отрицательный, индол не образует, сероводород не образует, крахмал не гидролизует. Утилизирует аммониевые соли и нитраты, пигмент не образует. Уреаза, оксидаза, каталаза - положительно. Поглощение кислорода аэробное. Желатину не окисляет. Лакмусовое молоко окрашивает в красный цвет, пептонизирует. Температура развития 10-37 0, оптимальная температура роста 26-31 0, рН развития , оптимально 6-8. Метиламин не утилизи-рует. Не образует газообразной кислоты из Сахаров - арабинозы, адонитола, инозитола, галактозы, ксилозы, клюкозы, сахарозы, дульцитола, сорбитала, трегалозы, мальтозы, маннитола, маннозы, лактозы, рамнозы, раффинозы, фруктозы, крахмала и глицерина . Не утилизирует сахара - арабинозу, инозитал, галактозу, ксилозу, сахарозу, сорбитал, трегалозу, мальтозу, маннитол, маннозу, лактозу рамнозу, раффинозу, фруктозу, крахмал, декстрин, инулин, метилглюкозид, рибозу, сорбозу, фукозу, целлобиозу, мелебиозу и глицерин. Утилизирует глюкозу. Утилизирует метанол. Не утилизирует метан. Не утилизирует спирты - этанол, проланол, изопропанол, бутанол, амиловый спирт, изоамиловый спирт; 1, 2-пропандиол; 1,3 бутандиол-, 1,4-бутандиол; 2,3-бутандиол; 1,5пентандиол, 1,6-гександиол, 2,5-гександиол; этиленгликоль, диэтиленгликоль} 4-метилциклогексан. 5 Не утилизирует органические кис лоты - муравьиную, уксусную, фумаровую, лимонную, молочную, пировиноградную, изолимонную, кетоглутаровую, коричную, яблочную, оксиуксусную, гликолевую, глиоксиловую и глюконовую. Количество метанола в питательной среде не должно быть выше 4% объема среды, а в случае непрерывной подачи метанола в среду его содержание не должно быть выше % по объему. В качестве неорганических источ ников азота используют нитрат аммо ния, калия, сульфат аммония и т.п. и дрожжевой экстракт, пептон и т.п. в качестве природного источ ника азота. В качестве минеральных солей используют кислый фосфат калия, двухкалийный фосфат калия, сульфат магния, сульфат железа, хлорис тый кальций, сульфат марганца, хло рид натрия и т.п. В среду вводят также биотин, тиамины, дрожжевой экстракт, кукурузную барду в случа необходимости. Культивирование проводят при 10-37 С, предпочтительно при 28-32 при встряхивании или перемешивании воздухом, рН среды 5-10. предпочти Ь-ельно 6-8 или 6,5-7,5, продолжительность культивирования 2 ч, пр почтительно ч. По окончании культивирования вы ращенный бульон разбавляют в 1020 раз по объему, мицелий и другие твердые вещества удаляют непрерывным центрифугированием при 1500 х X 60 мин и скорости обработки 20 л/ или периодическим центрифугированием при 1000 X 60 мин. Затем к отдел ному бульону добавляют органический растворитель, например метанол, эта нол или ацетон в удвоенном объеме, или соль четвертичного аммония для фракционирования осаждения бело го волокнистого сырого полисахарида I Полученный полисахарид растворяют в 5-15 ратном объеме воды и полученный раствор подвергают депротеинизации, например, нагревание при 70-100°С, обрабатывают смесью хлороформа и эмилового спирта (3-2) или обрабатывают трихлоруксусной кислотой. Затем непрерывно или периодически центрифугируют так же как сырой полисахарид для удаления 56 протеинов. К полученному верхнему слою добавляют двойной объем метанола, этанола или ацетона. Отделенный осадок тщательно промывают эфиром или этанолом, снова растворяют в 5-15-кратном объеме воды и деминерализуют диализом в проточной воде, обрабатывают ионообменной смолой и фильтруют через гуль, сушат вымораживанием и получают полисахарид в виде белой губки. Физико-механические свойства полисахарида. Оптическое вращение (ct) , ± 3(3(О, II по объему водный раствор) . Средний молекулярный вес 2,0 х X 10 - 2,0 X 10 (зависит от длительности ферментации). Элементарный анализ, %: С 37,7+ ± 3,0} Н 5,8 ± 0,5. Цветная реакция положительна в антроновой реакции и фенол-сернокислотной реакции. Полисахарид представляет собой кислотный элемент. ИК-спектр - характерные полосы поглощения, см -при (S), (М), 1620 (М), (М), (S) и 890 (W). Растворим в воде, 1н. НС1, 1 н. серной кислоте и 1 н. водном аммиаке. Нерастворим в этаноле, эфире, ацетоне, хлороформе и диметилсульфоксиде. Вязкость 1000-3000 сП измере+на в его 1 вес. растворе при с помощью вискозиметра типа 81 (фирмы Токио Тейки, Япония). Сахарные единицы - пятна глюкозы и маннозы бумажной хроматографией после гидролиза, отношение сахарных единиц глюкозы к маннозе 3 :2 по газовой хроматографии. Полисахарид белого цвета, аморфный и бесцветный в водном растворе. Из указанных свойств можно сделать вывод, что полисахарид, выделенный из бульона нового штамма М-30, обладает высокой вязкостью в водных растворах, которая не снижается даже в присутствии соли, например, КС1, MgClij, AlClo,, ()/2.S04 или aCl. Вязкость водного раствора полисахарида незначительно изменяется при изменении рН среды. Поэому он пригоден в качестве добавки в корм, носителя для лекарств и косетических веществ, или промышлен7

ных химикатов, Например смазок для бурения.

В медицине полисахарид М-30 - С пригоден в качестве вещества, снижающего уровень холестерина.

Ниже более полно дано объяснение снижения холестерина полисахаридом М-ЗО-С на различных опытных данных.

Величина Делполисахарида М-ЗО-С не мене 5 г/кг в штамма 1СР - С для самок и Самцов мышей и штамма бистер для самок и самцов крыс при пероральном введении, в то время как величина ЕД оПодавляющего действия на рост уровня холестерина в крови не более 5 мг/кг в случае гиперлипемии, вызванной Тритоном

Таким образом безопасная зона (LD5Q(ED5j) полисахарида составляет 1000 раз и больше. Подострая токсичность в течение 1 месяца введения показывает, что нет никаких ненормальностей в веса тела, крови и органов при непрерывном введении 500 мг/кг день; максимальная безопасная доза составляет 500 мг/кг.

Полисахариды показывают высокую безопасность, как лекарство и применяются в медицине для улучшения обмена липидов и предотвращения атергеноза.

Полисахариды можно вводить перорально, внутривенно, прд язык, внутримышечно или интраректально, предпочтительно перорально, обычно одинарными дозами 10-1000 мг 1-6 раз в день для взрослых.

В некоторых случаях полисахариды можно давать после соответствующего расщепления или сульфирования. J Полисахарид Н-ЗО-С можно давать, как лекарство для улучшения липидного обмена и предотвращения атеросклероза, инфаркта миокарда, грудной жабы, размягчения мозга, мозгового кровотечения, гипертонии или гиперхолестермии, связанной с диабетом.

Для перорального применения обычно используют капсулы, таблетки или гранулы, в некоторых-случаях порошки сиропы или водные растворы, причем полисахарид М-ЗО-С дает эффект в менших дозах по сравнению с известными противохолестерическими веществами, обладает безопасным пределом, не вызывает гепатотоксичности, обычной для побочного действия.

158.

Пример. Получают питательную среду, содержащую в 1 л чистой воды следующие ингредиенты, г: кислый фосфат калия 1; нитрат калия 1, семигидрат.сульфата магния 0,5; хлорид калия 0,5, дрожжевой экстракт 0,1-, метанол 32 и в мг: семигидрат сульфата железа 10, дигидрат хлорида кальция 2 и хлорид натрия 2. 7 литров- среды помещают в ферментер с рН 7.0, стерилизуют 10 мин при 120С.

В среде такого же состава выращивют штамм Pseudomonas polysaccharogenes М-30 в колбе Сакагуси, инокулируют в указанный ферментер, ведя культивацию при 30°С и аэрации 0,5 объема/мин в течение 72 ч. Далее к бульону добавляют 100 л воды, мицелий отделяют непрерывным центрифугированием при 2000 об/мин и 7 л/ч Затем отделенный фугат нагревают до 80°С 15 мин. рН доводят до 3,5-,5 соляной кислотой для осаждения .протеинов в изоэлектрической точке, затем протеины отделяют центрифугированием, рН слива доводят до 7,0 выпаривают до 25 л, обрабатывают смесью хлороформ-амиловым спиртом (3:2) для депротеинизации и-добавляют 50 л ацетона, при этом образуется вязкое вещество волокнистой структуры. Это вещество отфильтровывают, тщательно промывают затем этанолом, снова растворяют в воде и подвергают диализу.

Для отделения полисахаридов добавляют двойной объем ацетона. Полисахарид растворяют в 2 л чистой вода затем сушат вымораживанием и получают 98 г очищенного полисахарида М-ЗО-С, Его продуктивность составляет 1 г/л культурального бульона.

Физико-механические свойства полученного полисахарида.

Средний молекулярный вес 18 х 10 по фильтрации геля и 12 х 10 по рассеиванию света. Элементарный анализ, %: С 37,7. Н 5,8.

Цветная реакция положительна в реакции антрона и фенолсерной кислоты .

Полисахарид М-ЗО-С является кислотным полисахаридом.

ИК-спектр поглощения. Характерные полосы поглощения выражены волновым номером, (S), 2940 (М) , 1620 (М), 1400 (М), 1040 (3)и 890 ОЛ S I где S - показывает сильное поглощение, м - среднее поглощение, и W - слабое поглощение. Полисахарид растворим в воде, в 1н. соляной кислоте, 1н. серной кис лоте и 1 н.водном аммиаке. Нерастворим в этаноле, эфире, ацетоне, хл роформе и диметилсульфоксиде. Вязкость 1000-3000 сП в U-HOM водном растворе при 20°С и 60 об/ми на вискозиметре типа В (фирмы Токи Тейки, Япония). Изменение вязкости водного раств ра в зависимости от рН в диапазоне рН 2-М; несколько большая вязкост при нейтральном рН (при рН 2 вязкость 930 сП-, при рН 7-1250 сП и при рН 11-1100 сП на вискозиметре типа BL с адаптером НМ-3 для неболь шого количества при условиях 20°С, 0, водный раствор, и 60 об/мин В зависимости от температуры вязкос изменяется следующим образом. В диапазоне 20-80°С вязкость уменьшается при увеличении температуры: при 20°С - 13500 сП, при 80°С - 11100 сП на том же самом вискозиметре. Изменение вязкости водного раствора в зависимости от концентрации от 0,2 до % вес/объем : чем выше концентрация раствора, тем выше его вязкость, при Q,2% - 500 сП и при П - 13500 сП и 20С. Снижение вязкости водного раствора полисахарида не наблюдается в растворе хлорида калия, магния, алюминия, сульфата аммония или в насыщенном вод-ном растворе хлорида натрия. Полисахарид М-ЗО-С гидролизуется 2н. серной кислотой в герметичной трубке при в течение 9 ч Продукт реакции обрабатывают гидроокисью бария для удаления серной кислоты, затем пропускают через колонку с ионообменной смолой Довёк 50 (Н форма) для удаления избытка ионов бария и тонких частиц сульфата бария. Промывные жидкости выпаривают в вакууме. Концентрат хроматографируют на бумаге, применя .в качестве проявляющей жидкости сме бутанола, уксусной кислоты и воды (1:5),и получают пятна глюкозы и маннозы. Концентрат далее выпаривают досуха и превращают в соответствующее триметилсилильное производное, газовая хроматография котор 510 го показывает отношение глюкозы к маннозе 3:2. Полисахарид М-ЗО-С аморфный, белый, где водный раствор бесцветный. Полисахарид и его водный раствор не имеют вкуса и запаза. Полисахарид более вязок, чем ксантановая смола, при 20°С, 1|-ном водном растворе, 60 об/мин и на таком же вискозиметре, вязкость полисахарида 2100 сП, у ксантановой смолы 1000 сП. Полисахарид М-ЗО-С показывает тиксотропное свойство в его водном растворе. Наблюдается слабое ультрафиолетовое поглощение около 280 мкм. Температура плавления полисахарида неопределенная, он разлагается при нагревании, переходя в науглероженное состояние. П р и м е р 2. Культивирование проводят, как описано в примере 1, получая культивированный бульон, содержащий полисахарид М-ЗО-С. Бульон разбавляют смесью воды и метанола 1:1 до 100 л и нагревают при 15 мин. Затем мицелий удаляют непрерывным центрифугированием при скорости 7 л/час.„ рН слива доводят до 3,,5 соляной кислотой для осаждения протеинов в изоэлектрической точке и затем протеины отделяют центрифугированием. Снова рН слива доводят до 7,0 и добавляют водный раствор хлорида кальция до концентрации 0,02 %. При дальнейшем центрифугировании получают пастообразный полисахарид, который обрабатывают 20 л метанола при осторожном перемешивании для удаления солей, фильтруют, отгоняют метанол и получают полиса харид в виде пасты. Пасту растворяют в 2 л чистой воды, сушат вымораживанием, получая 84 г очищенного полисахарида М-ЗО-С. Производительность равна 12 г/л бульона. Фармакологические свойства полисахарида Н-ЗО-С поясняются следующим образом. Опыт 1. Берут самцов мышей штамма 1CR-JCL группами по 10 мышей, каждой из них внутривенно вводят по 800 мг/кг Тритона. Через ч после введения в крови образуется пиковый уровень липидов крови, затем гиперликемию поддерживают более 2 ч, готовя таким образом опытных животых. Затем опытную пробу полисахаида М-ЗО-.С растворяют в дистиллироnванной воде и дважды перорально вво дят животным, а именно сразу после дачи Тритона и через 20-2А ч. Через 2k ч после последнего введения определяют уровень холестерина в сывооотке. Опыт 2. Берут самцов мышей, как в опыте 1 по 6 штук в группе, и каж дой мыши вводят внутривенно стрепто озотоцин 200 мг/кг. Чеоез 7 ч после введения поддерживают гиперлипемию в течение I дней и более для получения животных с гиперлипемией, вызванной стрептоозотоцином. Пробу полисахарида М-ЗО-С раство ряют в дистиллированной воде и перо рально вводят животным одиночными дневными дозами 50 мг/кг в течение 5 дней после 7 дней с момента введе ния стрептоозотоцина. Через 2 ч после последнего введения определяют уровень холестерина. Опыт 3. Берут самцов крыс штамма Вистар 3 группы по 10 животных. В группе нор марный контроль находятся животные, которым дают обычную порошкообразную пищу. Подопытным животным группы холестериновый контроль дают пищу с добавлением 0,5% холестерина и 0,5% желчной кислоты. В группе М-ЗО-С животным дают пищу, содержащую компоненты из группы холестериновый контроль и испытываемый полисахарид М-ЗО-С, приготовленный таким образом, что животные получают дневную дозу 50 мг/кг. Одновременно во всех группах поднимают холестерин в плазме: пищу дают в количестве 10 г на 100 г веса тела в день. После кормления 1 дней определяют уровень холестерина в сыворотке. 5 В опытах 1-3 применяют также гипохолестериновый агент (СР1В) для сравнения. Результаты опытов 1-3 приведены в табл.1. Опыт Ц. Берут самцов кроликов штамма новозеландские-белые группами по 10-1 животных. Животных, которым дают обычную пищу называют нормальный контроль, пищу, содержащую 0,67 холестерина - холестериновый контроль, пищу с добавлением испытуемой пробы М-ЗО-С - группа, получившая испытуемое соединение , Уровень холестерина в плазме во всех группах одновременно повышают ежедневной дачей пищи 40 г/кг веса тела в течение 20 недель, За этот период определяют уровень липидов в сыворотке. Через 20 недель всех животных забивают, вырезают дорсальную аорту и изучают явление атеро клероза. Результаты приведены в табл.2 Из данных табл.2 видно, что полисахарид М-ЗО-С значительно подавляет рост липидов в сыворотке (общий свободный холестерин, триглицериды, фосфолипиды, липопротзин, свободные жирные кислоты), 65,9% атеросклероза обнаруживают в дорсальной аорте в группе холестеринового контроля и в то же время подавления атеросклероза наблюдается в группе животных, которым давали полисахарид М-ЗО-С. Снижающее действие на липиды в сыворотке М-ЗО-С происходит, видимо, за счет эффекта подавления поглощения и биосинтеза холестерина. Таким образом, полисахарид М-ЗО-Т можно считать пригодным в качестве практического вещества, снижающего липиды в сыворотке и предотвращающего развитие атеросклероза.

та

гг

S

q lO

та

03

J s ц ю

OJ

1792901518

Формула изобретенияотличающийся тем, что,

Способ получения полисахарида пу- сахарида, из рода Pseudomonas испольтем культивирования продуцирующих зуют штамм PseixioiTOnas polysaccharoего микроорганизмов рода Pseudonronas 5 genes М-30, при этом культивирование на питательной среде в условиях аэ- ведут при рН 6,5-7,5 и 2В-30с в течерации, содержащей метанол в качестве ние 8-72 ч. единственного источника углерода.Источники информации,

источники азота, фосфора и другие принятые во внимание при экспертизе необходимые минеральные соли, с по- Ю 1. Заявка Франции № 22317 8, следующим выделением полисахарида, кл. С 12 D iS/OH, опублик. 1975.

с целью увеличения активности поли