Способ определения активности коллагеназы Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

vl

00

:л: vi

Изобретение относится к биохимии а более конкретно к определению активности коллагеназы, и может быть использовано в производстве колла- геназы, а также В биохимических исследрвани.ях., Целью предложения является упрощ ние способа. . П р и м е р. В стеклянные градуи рованные трубочки набирают по 0,05 мл стекловидного тела глаза кролика (для каждого измерения используют по три параллельные пробы) В отмеренные объемы стекловидного тела с помощью микрошприца вводят по 0,01 мл раствора коллагеназы (150 Ед/мг), содерлсащего фермент в различных количествах (0,15-0 мг). Активность коллагеназы от пробы к пробе искусственно снижают от 22,5 до О Ед, замещая фермент Эквивалент ным количеством сывороточного альбу мина путем смешивания растворов эти белков. В часть контрольных проб с интактным стекловидным телом вводят по 0,01 мл дистиллированной воды, в другую часть - раствор коллагеназы, предварительно инактивиров5нной нагреванием при 60°С в течение 15 мии Все пробы инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 мин. Реакцию 3172 останавливают нагреванием проб при 60°С в течение 15 мин. Далее пробы стекловидного тела переносят в отдельные чашки Петри и распределяют на днр в пределах окружности диаметром 15 мм. Чтобы избежать движений воздуха и неравномерной скарости испарения проб, чашки наполовину прикрывают крьшками. Момент нанесения проб и момент их полного высыхания регистри 3у1от. Высушивание проводят при 20-22°С. Активность коллагеназы определяют как отношение времени высыхания контрольных проб стекловидного тела ко времени высыхания проб с исследуемым ферментом и выражают в относительных единицах. Известную активность коллагеназы, выраженную в Ед/мг, можно сопоставить с относительными единицами активности, полученными предлагаемым способом. Например, после обработки пробы стекловидного тела коллагеназой, имеющей активность 10,5 Ед, ее. относительная активность равна 1,095..Поскольку между сравниваемыми величинами нет линейной зависиг,мости, то для удобства перевода относительных единиц активности исследуемых препаратов коллагеназы в известные можно составить соответствующую номограмму, .

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КОЛЛАГЕНАЗЫ путем смешивания коллагеназы с предварительно подготовленным субстратом, инкубации реакционной смеси, остановки ферментативной реакции и определения степени гидролиза субстрата, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, п качестве субстрата используют стекловидное тело глаза, ферментативн то реакцию останавливают прогреванием реакционной смеси при 54-63 с в течение 10-20 мин, а о степени гвдролиза субстрата судят по скорости высыхания реакционной смеси, причем больша я скорость высыхания со ответствует большей сгепени гидролиза. СО с: