Способ определения эндо- @ (1-4) глюканазной активности Советский патент 1984 года по МПК C12N9/36 C12Q1/34 

Изобретение относится к энзино-лбгии, ьикробиологии и микробиологической промышленности, а именно к способам определения активносоги ферментов,

Известен способ определения активности целлкшолитических ферментов с использованием нераСтворим ш окрашекзтых субстратов, который включает ферментативный гидролиз субстрата, кипячение реакционной смеси, фильтрацию и последующее определение оптической плотности фильтрата, по которой судят о ферментативной активности П1

Недостатком такого способа является то 5 что при этом определяется только общая активность целлюпазного комплекса, а, не активность отдельных ферментов, в частности эндо-(1- 4)-глюканаз (называегф х в дал.ьнейшем для краткости эндоглгаканазами) ,

Известно также способ определенр я эндо-Jbil- 4) глюканазной активности (так называемой вискозиметрический метод 5 который включает феркентатывный гидролиз растворимого субстрата (карбоксиметилцеллкшозы) и опредепение начальной скорости уменьшения относительной вязкости раствора.

Этот способ позволяет рассчитать по вискозиметрическим данным абсолютную эндоглюканазную активность (мкмоль расщепленных связей в 1 f«iH) C2l.

Недостатками указанного способа являются его низкая производительность (5 определений в час) и низкая точность (ошибка 10% и более).

Цель изобретения повышение точности и производительности определения эндо- А ()-глгоканазной активности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения эндо-Jli-(fl 4)глюканазной актив-кости путем ферме ггативного гидролиза растворимого субстрата в качестве субстрата применяют карбок™ симетилцеллншозу, окрашенную активными красителями нафталинового ряда содержащими $-3 сульфогруппы в нафталиновом ядре, часть субстрата, не подвергшегося гидролизу, осаждают 0,5-3,0 объемаьи органического растворителя с добавлением электролита до концентрации 5,0-50,0 мМ,, измеряJoт oптичecкyю плотность полученн от д

12058 .2

фкшьтрата, а эндо-/ -(1- 4 глюканазнуго активность определяют по оюрмуле

D.V

(1)

1000,

D

- оптическая плотность фильтрата

V - объем | еакционной смеси,мл;

t -« время гидролиза субстрата, мин;

m - количество ферментного препарата, взятого дпя анализа, мг.

Обычно используют карбоксиметклцрдлюлозу„ окрашенную активным ярко -орагскевым ЖТ 1-ши ремазолом красным 28 или ярко-красным 2СХ, или активным Ш1ЫМ 4ЖТ,

В качестве органического растворителя обычно используют этанол или метанол, или монометиловый эфир этиленгликоля, а в качестве электролита - СаС Ij или КС i 5 или ZiiC, ьши MgSO

Применение в качестве субстрата карбоксиметилцеллюлозы, окрашенной Заказанными красителями, позволяет повысить производительность определеifflH знгдо- а,-(1- 4 -глюканазной активности целлюлазныхкомплексов по сравнению с известным способом. Производительность предлагаемого способа состаапяет 20 определений в час, тогда как известного - 5определений в час. Благодаря стабильности окраски фильтратов описываемый способ дает возможность раздельно проводить ферментативную реакцию с погледукхо тм осаждением и измерение оптических плотностей фильтратов, что позволяет одновременно определить 3Hfl,o-fj. ()-глюканазную активгшсть большего количества образцов. Известный способ позволяет одновременно определить шстивность только одного образца.

Проведена сравнительная оценка

точности предлагаемого метода с известным на. примере определения эндоглюканазной активности целлобронина ГШх,

Средний коэффициент вариации равен 459-553%, а по известному способу - 11%. Из этого следует, что точность предлагаемого способа, определения активности эндо-;; 1- 4)глюканаз превьшает точность известного способа почти в 2 раза. . Описывае1Ф1й способ определения эндоглюканазной активности проверен на следующих целлюлазных препаратах целловиридин ГЗх, целлобронин , пектофоетидин ГЗх, целлокандин ГЗх, ферментный препарат фирмы Рапид аз а (Франция). Пример 1. В ацет.атном буфаре (рН 4,5) готовят 1%-ный раствор карбоксиметилцеллюлозы, окрашен ной активным красителем ярко-оранже вым ЖТ субстрат) . Концентрация целлобронина ГЮх в ацетатном буфер . (рН 4,5) 1,0 мг/мл. В пробирку нали вают 5 мл раствора субстрата, термо статируют при в течение 3 мин, приливают 1 мл ферментного раствора взбалтывают и инкубируют при ровно 10 мин, после чего добавляют 5 мл осадителя (80%-ный этанол, содержащий 25 tM CaClz). Реакционну смесь взбалтывают, выдерживают в течение 1 мин для полного выпадеНИН осадка и фильтруют через бумажный широкопористый фильтр, после чего определяют оптическую плотност фильтрата на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М (фильтр 5, Л 490+10 против контрольной пробы. Для приготовления контрольной пробы в пробирку наливают 5 мл раствора субстр та, 5 мл осадителя, взбалтывают, до бавляют 1 мл ферментного раствора, выдерживают в течение 1 мин и фильт руют через бумажный фильтр. Оптическая плотность 0,31. Эндоглюканазную активность иссле дуемого препарата рассчитывают по формуле (IX ЗА усл. ед/ , -4Д JL.« 10.1 Пример 2. В ацетатном буфере (рН 4,5 готовят 2%-ный раство карбоксиметилцеллюлозы, окрашенной активным красителем ремазолом красным 2Б. Концентрация целловиридина ГЗх в ацетатном буфере (рН 4,5) 3 мг/мл. В пробирку наливают 2 мл раствора субстрата, термостатируют при в течение 5 мин, приливают I мл ферментного раствора, взбал тывают и инкубируют при ровно 10 мин, после чего добавляют 6 мл осадителя {80%-ный монометиловый эф этиленгликоля, содержащий 50 мМ ZnClu), Реакционную смесь взбалтывают, выдерживают в течение 5 мин для полного выпадения осадка и фильтруют через бумажный фильтр, после чего определяют оптическую плотность фильтрата на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М .фильтр 5,.10 инЛ против контрольной пробы. Для приготовления контрольной пробы в пробирку наливают 2 мл раствора субстрата, 6 мл осадителя,взбалтывают,добавляют . 1 МП ферментного раствора, выдерживают в течение 5 мин и фильтруют через бумажный фильтр. Оптическая плотность 0,330. Эндоглюканазную активность рассчи гывают по (1) ЗА --f --:5-1000 99 у ел. ед/г. 10 3 Поимер 3. В ацетатном буфере ( рН 4,5 готовят 2%-ный раствор карбоксимет1-шцеллюпозы, окрашенной активнь м красителем алым 4ЖТ. Концентрация пектофоетидипа ГЗх в ацетатном буфере (рН 4,5) 3 мг/мл. В пробирку наливают 2 мл 2%-ного раствора субстрата, термостатируют при 40°С в течение 5 мин, приливают i мл ферментного раствора, взбалтывают и инкубируют при ровно 10 мкн, после чего добавляют 9 мл осадителя (смесь 8 мл и 1 МП вод1юго 50 мМ раст- t вора КС1), взбалтывают, выдерживают 5 мин для полного выпадения осадка и фильтруют через бумажный фильтр, после чего определяют оптическую плотность фильтрата на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М (фильтр 5, i 490+10 им) против контрольной прооы. Для приготовления ко}1трольной . пробы в пробирку наливают 2 мп раствора субстрата, 9 мл осадителя, взбалтывают, добавляют 1 мл ферментного раствора, выдерживают в течение 5 мин, после чего фильтруют через бумажный фильтр. Оптическая плотность 0,23. Эндоглюканазную активность исследуемого препарата рассчитывают по формуле (1) ЭА 4|--|- 1000 92 усл.ед/г. Ш 3 Пример 4. В ацетатном буфере ( рН.4,5 готовят 1%-ный i л створ карбоксиметилцеллюлозы, окрашенной активным красителем ярко-красным 2СХ. Концентрация целлюлазного препарата Рапидазы ;(Франция) в ацетатном буфере /(рИ 4,5) 0,2 мг/мп. В пробирку наливают 5 мл раствора субстрата, термостатируют при в течение 5 мин, приливают 1 мл фер ментного раствора, взбалтывают и ин кубируют при 40°С ровно 10 мин, пос ле чего добавляют 3 мл осадителя (смесь 80%-ного этанола и изопропанола 1:1, содержащая 5 мМ MgSO/,) . Реакционную смесь взбалтывают, выде живают 1 мин для полного выпадения осадка и (фильтруют через бумажный фильтр, после чего определяют оптическую плотность фильтрата на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М (фильт 6, JL 540+10 нм)) против контрольной пробы. Для приготовления контрольной пробы в пробирку наливают 5 мл раствора субстрата, 3 мл осадителя, взбалтывают, добавляют 1 мл фермент ного, раствора, выдерживают в течение 1/мин и фильтруют через бумажны фильтр. Оптическая плотность 0,48. Эндоглюканазную активность рассч тывают по формуле (1) ЭА - 2 1000 2160 усл.ед 10 , 0,2 Характеристики использовантшх препаратов приведены в табл. 1. Из табл. 1 видно, что корреляция имеется только ме у данными второй и шестой колон- ;, т.е. между эндоглюканазной актив )стью и актив ностью, найденной по п зедлагаемому способу /(см. чертежJ. В то же время никакой корреляции между активностя ми других компонентов целлюпазного комплекса и активностью по окрашенной карбоксиметилцеллюлозе Спредлаг мый способ не наблюдается. Таким образом, предлагаемый метод пригоден для селективного определения активности- эндоглюканазы в целлюлазных комплексах в присутстви других компонентов. I На чертеже приведена коррелляционная зависимость между эндоглюканазной активностью, определенной при помощи предлагаемого способа, и данными, полученными вискозиметрическим способом. На чертеже обозначены: точка 1 пектофоетидин ГЗх; точка .2 - целлониридин; точка 3 - целлокандин ГЗх; точка 4 - целлобронин Г10х; точка 5 ферментный препарат Рапидаза. Кроме того, существует возможность пересчета полученных по формуле (Т) условных единиц в международные (AME(.) с тем, чтобы можно было сравнивать данные, полученные в разных лабораториях. Формула пересчета следующая: ЭА К t . Мб1нд ц. где К - тангенс угла наклона, измеренный для карбоксиметилцеллюлозы с данной степенью окраски;3)- оптическая плотность 0,1%ного раствора окрашенной карбоксиметилцеллюлозы, использованной для построения калибровочного графика до на. чала реакции; Т)- оптическая плотность 0,1%ного раствора окрашенной карбоксиметилцеллншозы из другой партии. Отнощение ) введено в формулу для того, чтобы небольшие (на 10-20 %) изменения степени окраски карбоксиметилцеллюлозы не сказывались на определении абсолютной активности. Предлагаемый способ определения эндо-| (1-у 4 глюканазной активности в целлюлозных комплексах по сравнению с известным обеспечивает.повышение производительности определения примерно в 4 раза, повышение точности определения в 2 раза, а возможность пересчета полученных условных единиц в международные единицы активности.

1112058

7

8

Т а лица

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДО-р ( - 4 N ГЛЮКАНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ путем ферментативного гидролиза растворимого субстрата, отличающий с я тем, что, с целью повышения точности и производительности определения, в качестве субстрата используют карбоксиметилцеллкшозу, окрашенную активными красителями нафталинового ряда, содержащими 1-3 сульфогруппы в нафталиновом ядре, часть субстрата, не подверпиегося гидролизу, осаждают 0,5-3.0 объемами органического растворителя с добавлением электролита до концентрации 5-50 мМ, измеряют оптическую плотность полученного фильтрата, а эндо-j (I- 4) глюканазную активность определяют по формуле D-v 1000, -i л -, JA - где V оптическая плотность фильтрата; V объем реакционной смеси, мл; время гидролиза субстрата, t мин; копичество ферментного преrrt парата, взятого для аналиО) за, мг, 2.-Способ по п. 1,отличающ и и с я тем, что используют карбоксиметилцеллюпозу, окрашенную активным ярко-оранжевым ЖТ, или ремазолом красным 2Б, или ярко-красным 2СХ, или активным алым 4 ЖТ. 3.Способ по п. 1,отличающ к и с я тем, что в качестве органического растворителя используют этанол или метанол, или монометиловый э4ир этиленгликоля, а в качестве электролита - CaCl, или КС1, или ZnCl . или MsSOi,

80-100 30-40

20

30

15

Ферментный

препарат

фирмы Рапидаза fФранция)

Целлокандин

45 ГЗх

25

с помощью методов, описанных по предлагаемому способу

Предлагаемый По примеру I

Известный

35 1

341

8 1

84

il 25

56

1845

10 10

233

Таблица

9К,9.е91

|Ш

т

т

т

W А, межд.ед1г

т