СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕЙТРАЛЬНОЙ КОЛЛАГЕНАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12Q1/34 C12N9/50 C12N9/52 C12N9/64 

Изобретение относится к энзимологии, пищевой промышленности, а также медицине и может быть использовано для контроля препаратов коллагеназы.

Известен способ определения активности коллагеназы путем инкубирования в течение 48 ч при 37^оС ряда разведений испытуемой пробы в изотоническом растворе хлорида натрия с проколлагеновой пленкой диаметром 2 мм, содержащей 1,5 мг белка, в присутствии хлорида кальция с последующим выявлением максимального разведения пробы, обеспечивающего полный лизис пленки (Временная фармакопейная статья ВФС 42-1356-83).

Этот способ нестандартный и неудобный для использования из-за трудоемкости предварительной процедуры приготовления проколлагеновой пленки из хвостов крыс. Его низкая точность обусловлена также шагом разведения испытуемой пробы.

Известен также способ определения активности коллагеназы в фермент-субстратной реакции со стекловидным телом глаза в течение 30 мин при 37^оС с последующей остановкой реакции прогреванием и учетом ее результата по времени высыхания реакционной смеси (авт.св. СССР N 1173317, кл. G 01 N 33/48, 1983).

Этот способ также неудобен и неточен из-за используемого субстрата и визуальной оценки результата.

Возможно также определение коллагеназной активности путем инкубирования анализируемой пробы с коллагеном и последующего учета реакции по концентрации оксипролина (Schalinatus E. Behnke U. Ruttloff H./Nahrung, 1978. Вd 22, s. 401-408).

Данный способ трудоемкий, дорогой и требует дефицитных реактивов при проведении операции аминокислотного анализа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности коллагеназы в реакции расщепления коллагена, предусматривающий инкубирование коллагена, предварительно окрашенного конго красным, с испытуемой пробой в трис-буфере в присутствии хлорида кальция с последующим охлаждением (для остановки реакции), фильтрованием и фотометрированием продукта реакции (Полонская Л.Б. Рассулин Ю.А. Цыганкова В.Н. и Раджабов Л.Р. Метод определения коллагенолитической активности с нерастворимым конго коллагеном. Лабораторное дело, 1974, N 4, с.213-216).

Однако этот способ обладает низкой точностью.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Установлено, что низкая точность прототипного способа обусловлена нестойкостью красителя (конго красного), который частично переходит в фотометрируемый раствор даже в отсутствии коллагеназы, тем самым искажая результат измерения.

В предлагаемом способе произведена замена красителя на активный оранжевый ЖТ (выпускается согласно ТУ-6-14-625-85). При этом в реакционную смесь дополнительно вносят хлорид натрия и устанавливают в ней следующее соотношение ингредиентов, мг, Испытуемая проба коллагеназы 5 ± 0,2; Коллаген 500 ± 20; Гидроксиметил- аминометан (трис) 240 ± 20; Хлорид кальция 110 ± 10 Хлорид натрия 170 ± 20; Дистиллированная вода Остальное
В данном составе реакционной смеси принципиально весовое соотношение фермента и субстрата, которое равно 1:100 (5:500=1:100). Это соотношение обеспечивает динамический режим реакции, заложенный в формулу учета ее результата.

Для учета реакции дополнительно определяют концентрацию белка в пробе и оптическую плотность фильтрата при полном растворении коллагена, что осуществляют ее постановкой при избытке фермента, либо при соответствующем увеличении длительности инкубирования реакционной смеси.

О результате анализа судят по формуле:
A=377,8 где А активность коллагеназы, КЕ/мг;
Е оптическая плотность фильтрата в пятикратном разведении при длине волны 510 нм;
а оптическая плотность фильтрата при полном растворении 1 мг коллагена;
С концентрация белка в испытуемой пробе, мас.

t время реакции, мин.

Формула (1) получена с помощью нелинейного регрессионного анализа результатов определения активности 9 серий препаратов коллагеназы (по 3 измерения для каждой серии) предлагаемым способом и референс-методом, регламентированным ВФ 42-1356-83 (описан выше).

П р и м е р 1. Навеску 10 г коллагена из дермы крупного рогатого скота (пр-во "Олайне") обрабатывают 0,5%-ным раствором красителя активного оранжевого ЖТ (ТУ 6-14-625-85) при рН=8,0 в течение 2 ч при 40^оС, затем промывают водой от избытка красителя и высушивают при комнатной температуре. Отношение краситель/коллаген от 20 до 200 мас.

В контролируемой пробе коллагеназы определяют концентрацию белка по Лоури. В данной пробе содержится 3,5 мас. белка.

В 6 пробирок вносят по 1 мл реакционных смесей, включающих испытуемую пробу коллагеназы, коллаген, гидроксиметиламинометан(трис), хлорид кальция, хлорид натрия и дистиллированную воду, при следующих концентрациях реагентов, мг, Испытуемая проба коллагеназы 5 Коллаген 500 Гидроксиметил- аминометан (трис) 240 Хлорид кальция 110 Хлорид натрия 170 Дистиллированная вода Остальное
Смеси готовят непосредственно перед проведением анализа, причем для каждой испытуемой пробы используют по 3 пробирки с последующим статистическим учетом результата при данном числе повторов.

Смеси инкубируют при 37^оС и оптимальном значении рН, причем 3 пробирки инкубируют в течение 40 мин, а другие 3 пробирки в течение 48 ч. В последних трех пробирках экспозиция обеспечивает полное растворение коллагена; их инкубируют один раз для каждой партии коллагена.

По окончании инкубирования пробирки с реакционными смесями охлаждают в водяном термостате до комнатной температуры, разводят в 5 раз добавлением трис-буфера, пропускают через бумажный фильтр и определяют оптическую плотность фильтратов при длине волны 510 нм. В данном примере оптическая плотность пробы Е 0,135 ± 0,002, а оптическая плотность полного перевара 1 мг коллагена а 0,125 ± 0,001. Таким образом, для данной реакции: t 40 мин; а 0,125; С 3,5 мас. Е 0,135. Из этих исходных данных по формуле (1) определяют коллагеназную активность пробы:
A=377,8 377,8[3,5·0,135:(0,125·40)]^0,56 101 ± 1 КЕ/мг
П р и м е р 2. В качестве субстрата используют окрашенный оранжевый ЖТ коллаген, полученный в примере 1.

В контролируемой пробе коллагеназы определяют концентрацию белка по Лоури. В данной пробе содержится 2,7 мас. белка.

В 3 пробирки вносят по 1 мл реакционных смесей, включающих испытуемую пробу коллагеназы, коллаген, гидроксиметиламинометан (трис), хлорид кальция, хлорид натрия и дистиллированную воду при следующих концентрациях реагентов, мг Испытуемая проба коллагеназы 4,8 Коллаген 520 Гидроксиметил- аминометан (трис) 220 Хлорид кальция 100 Хлорид натрия 150 Дистиллированная вода Остальное
Смеси готовят непосредственно перед проведением анализа, причем для каждой испытуемой пробы используют по 3 пробирки с последующим статистическим учетом результата при данном числе повторов.

Смесь инкубируют при 37^оС в течение 80 мин. Реакцию до полного растворения коллагена не ставят, так как используют ту же партию коллагена, что и в примере 1.

По окончании инкубирования пробирки с реакционными смесями охлаждают в водяном термостате до комнатной температуры, разводят в 5 раз добавлением трис-буфера, пропускают через бумажный фильтр и определяют оптическую плотность фильтратов при длине волны 510 нм. В данном примере оптическая плотность пробы Е=0,163± ± 0,003, а оптическая плотность полного перевара 1 мг коллагена а 0,125 ± 0,001 (определена в примере 1).

Таким образом, для данной реакции: t80 мин; а 0,125; С 2,7 мас. Е 0,163. Их этих исходных данных по формуле (1) определяют коллагеназную активность пробы:
A=377,8 377,8[2,7·0,163:(0,125·80)]^0,56 66 ± 1 КЕ/мг
П р и м е р 3. В качестве субстрата используют окрашенный оранжевый ЖТ коллаген, полученный в примере 1.

В контролируемой пробе коллагеназы определяют концентрацию белка по Лоури. В данной пробе содержится 3,2 мас. белка.

В 3 пробирки вносят по 1 мл реакционных смесей, включающих испытуемую пробу коллагеназы, коллаген, гидроксиметиламинометан (трис), хлорид кальция, хлорид натрия и дистиллированную воду при следующих концентрациях реагентов, мг Испытуемая проба коллагеназы 5,2 Коллаген 480 Гидроксиметил- аминометан (трис) 260 Хлорид кальция 120 Хлорид натрия 190 Дистиллированная вода Остальное
Смеси готовят непосредственно перед проведением анализа, причем для каждой испытуемой пробы используют по 3 пробирки с последующим статистическим учетом результата при данном числе повторов.

Смеси инкубируют при 37^оС в течение 100 мин. Реакцию до полного растворения коллагена не ставят, так как используют ту же партию коллагена, что и в примере 1.

По окончании инкубирования пробирки с реакционными смесями охлаждают в водяном термостате до комнатной температуры, разводят в 5 раз добавлением трис-буфере, пропускают через бумажный фильтр и определяют оптическую плотность фильтратов при длине волны 510 нм. В данном примере оптическая плотность пробы Е0,182 ± 0,003, а оптическая плотность полного перевара 1 мг коллагена а 0,125 ± ±0,001 (определена в примере 1).

Таким образом, для данной реакции: t100; а 0,125; С 3,2 мас. Е 0,182. Из этих исходных данных по формуле (1) определяют коллагеназную активность пробы:
A=377,8 377,8[3,2·0,182:(0,125·100)]^0,56 68 ± 1 КЕ/мг
П р и м е р 4. Шесть выемок одной и той же пробы препарата коллагеназы с содержанием белка С 4,1 мас. анализируют при различном соотношении ингредиентов реакционной смеси, указанном в табл.1.

Для анализа используют окрашенный как описано в примере 1, оранжевым ЖТ коллаген с оптической плотностью 1 мг полного перевара а 0,132.

Анализ проводят как в примере 2 при длительности инкубирования проб t 50 мин. Оптические плотности фильтратов и соответствующие им значения коллагеназной активности, рассчитанные по формуле (1), приведены в табл.1.

Как видно из табл. 1 при предлагаемом соотношении ингредиентов погрешность измерений не превышает 5% (104,7-100,0=4,7%). В запредельных режимах вариация измерений составляет: 108,8-95,213,6%
При пятикратном анализе той же пробы методом лизиса проколлагеновой пленки (референс-метод) установлена ее активность, равная 102 ± 18 КЕ/мг.

Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом и другими аналогами позволяет повысить точность определения коллагеназной активности. В связи с тем, что прямое доказательство этого положения по сравнению с прототипом затруднено из-за отсутствия в его описании градуировочной или иной математической зависимости коллагеназных единиц от оптической плотности фильтрата (в прототипе результат выражают в условных единицах без указания метода их пересчета в общепринятые коллагеназные единицы), в табл.2 приведены сравнительные результаты измерения коллагеназной активности 9 серий препаратов предлагаемым способом и путем лизиса проколлагеновой пленки (ВФС 42-1356-83).

Из анализа вариации приведенных в табл. 2 результатов видно, что предлагаемый способ на 13-38% точнее данного аналога.

В качестве испытуемых ферментных препаратов использовали коллагеназу из Clostridium histolyticum, коммерческие препараты фирм Merck и Wortington и др.

В качестве косвенного доказательства повышения точности по сравнению с прототипом в табл. 3 указаны результаты замеров оптической плотности фильтратов соответствующих реакционных смесей.

Из табл. 3 видно, что ошибка измерения, характеризуемая среднеквадратическим отклонением, в предлагаемом способе в 5-10 раз меньше, чем в прототипе. Это объясняется самопроизвольным переходом в буферный раствор значительной части используемого в способе-прототипе красителя коллагена.

Использование: энзимология, медицинская биохимия, пищевая промышленность. Сущность изобретения: навеску коллагена обрабатывают 0,5%-ным раствором красителя - активного оранжевого ЖТ при рН 8,0 и температуре 40°С в течение 2 ч (соотношение красителя и окрашиваемого вещества от 20 до 200 мас.%), отмывают водой от избытка красителя и высушивают при комнатной температуре. Составляют реакционную смесь, содержащую следующие концентрации реагентов, мг. %: испытуемая проба коллагеназы 5 ± 0,2, окрашенный коллаген 500 ± 20; трис 240 ± 20; хлорид кальция 110 ± 10; хлорид натрия 170 ± 20; дистиллированная вода остальное; инкубируют при оптимальных значениях t и рН среды; после завершения реакции пробы разбавляют в 5 раз трис-буфером, фильтруют и определяют оптическую плотность окрашенных растворов при 510 нм. Коллагеназную активность рассчитывают по формуле: A = 377,8 [CE/at]^0,56, где A - активность коллагеназы, КЕ/мг; E - оптическая плотность фильтрата в 5-кратном разведении; a - оптическая плотность фильтрата после полного растворения 1 мг окрашенного коллагена; C - концентрация белка в испытуемой пробе, мас.%, t - время реакции, мин. 3 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ НЕЙТРАЛЬНОЙ КОЛЛАГЕНАЗЫ, включающий инкубацию предварительно окрашенного коллагена с испытуемой пробой в трис-буфере в присутствии хлорида кальция, охлаждение, фильтрование и определение оптической плотности фильтрата, отличающийся тем, что коллаген окрашивают активным оранжевым ЖТ, в реакционную смесь добавляют хлорид натрия при следующем соотношении компонентов, мг.

Испытуемая проба коллагеназы 5 ± 0,2
Окрашенный коллаген 500 ± 20
Гидроксиметиламинометан (трис) 240 ± 20
Хлорид кальция 110 ± 10
Хлорид натрия 170 ± 20
Дистиллированная вода Остальное
а коллагеназную активность рассчитывают по формуле

где A активность коллагеназы, КЕ/мг;
E оптическая плотность фильтрата в 5-кратном разведении при 510 нм;
a оптическая плотность фильтрата при полном "переваривании" 1 мг коллагена;
C концентрация белка в испытуемой пробе, мас.

t время реакции, мин.