Способ подготовки бактерий для электронно-микроскопического исследования Советский патент 1989 года по МПК G01N33/569 C12Q1/00 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к методам электронной микроскопии бактерий.

Цель изобретения - сокращение длительности подготовки бактерий для электронной микроскопии.

П р ер 1. Бактерии Escherirr chia coli К-12, выращенные на плотной среде, петлей (3-4 петли) переносят в пробирку с фиксирующей смесью следующего состава, мас.%: Глутаральдегид 2 Уранилацетат0,5

Хлористый кальций 0,11

Ацетат-вероналовый

буфер (рН 6,0) Остальное

и фиксируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем к суспензии добавляют 3%-ный водньй раствор четырехокиси осмия в соотношении 1:1 и дофиксируют в течение 55 мин при комнатной температуре. Суспензию клеток центрифугируют и осадок дегидратируют в градиенте концентрации этилового спирта: (50% 10 мин) 70% 10 мин; 80% 10 мин; 90% 10 мин; 95% 10 мин; 100% (абсолютньй этиловьй

42

О)

сд

VI

4

фирт) 20 мин (3 смены). Пропитьюают о|бразцы в трех сменах абсолютного э тилового спирта и аралдита в соот- йошениях 3:1, 1:1, 1:3 при 37 С по 1,5ч в каждой, затем переносят в ч(истый аралдит и вьщерживают в вакуу- ф (10- - торр) 1,5 ч при . За- лючают образцы в аралдит и полимври- зуют при 90°С в течение 14 ч.

146

Предлагаемьй способ фиксаций и препарирования бактерий позволяет II течение 23 ч подготовить клетки к

1лектронно-микроскопичвским исследо1 аниям.

Изучение срезов бактерий E.Coli II электронной микроскопе показало, что тонкая структура клеток качест- иенно сохранена. На срезах вьивляютс псе ультраструктурные элементы клет- ;ш.

2,5 0,6 0,12

Пример 2. Бактерии JE.Coli К-12, выращенные на плотной среде, тетлей переносят в 3 мп фиксирующей меси, состоящей из следующих компо- Йентов, мас.%: Глутаральдегид Уранилацетат Хлористый кальций Ацетат-вероналовый буфер (рН 6,2) |и фиксируют в течение 10 мин при ком- |натной температуре. Затем к суспен- 1зии добавляют 4%-ный водный раствор четырехокиси осмия в соотношении 1:1 и дофиксируют в течение 50 мин при комнатной температуре, Дегидратацию образцов проводят аналогично примеру 1. Пропитывают клетки в трех сменах абсолютного этилового спирта и арал- дита в соотношениях 3:1,. 1:1, 1:3 при по 2 ч в каждой. Затем образцы переносят в чистый аралдит и выдерживают в вакууме (10 торр) 2 ч при 35°С. Заключают образцы в аралдит и полимеризуют при 80°С 16 ч.

Предлагаемый способ позволяет за 27 ч подготовить бактерии к ультраструктурным исследованиям.

Тонкая структура клеток E.Coli, препарированных с помощью этого способа, качественно сохранена.

Пример 3. Используют бактерии 18-часовой культуры К-12, выращенные на жидкой питательной среде. Примерно 2-3 мл сурпензии клеток центрифугируют и осадок суспензируют

Фиксацию и препарирование бакт рий для электронно-микроскопическ

25 исследований проводят в течение 2 Способ обеспечивает сохранность у траструктуры бактерий.

Пример 4. Бактерии E.Col К-12 фиксируют, дофиксируют, деги

30 ратируют аналогично примеру 2.Про тьгаают в трех сменах пропиленокси и эпона в соотношениях 3:1, 1:1,

Остальное при 37°С по 2 ч в каждой. Затем

35

40

45

образцы переносят в эпон и выдерж вают в вакууме (Ю- .торр) 2 ч при 37°С. Заключают образцы в эпо и полимеризуют при 90°С в течение

14 ч.

Исследование в электронном мик скопе ультратонких срезов E.Coli казало, что тонкая структура каче венно сохранена.

На фиксацию и препарирование б терий затрачивают 23 ч.

Пример 5. Бактерии E.Co К-12 фиксируют, дофиксируют, де ратируют, пропитьшают и заключаю аналогично примерам 1-4. Полимер цию образцов проводят при 65 С в течение 15 ч.

Было обнаружено, что полимери ция образцов при в течение является недостаточной, блоки им мягкую консистенцию и плохо режу 55 на ультрамикротоме.

Пример 6. Бактерии Baci thuringiensis щт,-52, выращвниые плотной среде 72 ч при З7 с, фик руют, дофиксируют, дегидратируют

ВО

0

в 3 мл смеси, состоящей из следующих компо не нтов, мае.%: Глутаральдегид Уранилацетат Хлористьй кальций Ацетат-вероналовый буфер (рИ 6,0) и фиксируют в течение 7 натной температуре.

Дофиксируют и дегидратируют аналогично примеру 1. Дегидратированные клетки выдерживают в пропиленоксида 10 мин при комнатной температуре. 5 Пропитьшают в трех сменах пропиленоксида и эпона при их соотношениях 5

2

0,5

0,11

Остальное мин при ком

3:i, 1:1,1:3 при по 1,5 ч в каждой. Затем образцы переносят в эпон и выдерживают в вакууме (Ю- торр) 1,5 ч при 37°С. Заключают образцы в эпон и полимеризуют при 70 С в течение 15ч.

Фиксацию и препарирование бакте- рий для электронно-микроскопических

5 исследований проводят в течение 24 ч. Способ обеспечивает сохранность улв- траструктуры бактерий.

Пример 4. Бактерии E.Coli К-12 фиксируют, дофиксируют, дегид30 ратируют аналогично примеру 2.Пропи- тьгаают в трех сменах пропиленоксида и эпона в соотношениях 3:1, 1:1, 1.3

при 37°С по 2 ч в каждой. Затем

при 37°С по 2 ч в каждой. Затем

5

0

5

образцы переносят в эпон и выдерживают в вакууме (Ю- .торр) 2 ч при 37°С. Заключают образцы в эпон и полимеризуют при 90°С в течение

14 ч.

Исследование в электронном микроскопе ультратонких срезов E.Coli показало, что тонкая структура качественно сохранена.

На фиксацию и препарирование бак-г терий затрачивают 23 ч.

Пример 5. Бактерии E.Coli К-12 фиксируют, дофиксируют, дегидратируют, пропитьшают и заключают аналогично примерам 1-4. Полимеризацию образцов проводят при 65 С в течение 15 ч.

Было обнаружено, что полимеризация образцов при в течение 15 ч является недостаточной, блоки имеют мягкую консистенцию и плохо режутся 55 на ультрамикротоме.

Пример 6. Бактерии Bacillus thuringiensis щт,-52, выращвниые на плотной среде 72 ч при З7 с, фиксируют, дофиксируют, дегидратируют.

О

пропитывают, заключают и полимери- зуют аналогично примеру 1.

Электронно-микроскопическое изучение ультратонких срезов спор Вас. thuringiensis показало, что тонкая структура споровых клеток качественно сохранена. Вьивляются все ультраструктурные элементы спор.

Пример 7. Бактерии Вас. thuringiensis шт.-52, выращенные на жвдкой среде, фиксируют, дофиксируют, дегидратируют, пропитывают, полимв- ризуют аналогично примеру 3.

Ультраструктура споровых клеток Вас. thuringiensis, фиксированных и препарированных по предлагаемой методике, качественно сохранена.

П р-и м е р 8. Бактерии Bacillus зрр. шт.18, вьфащенные на плотной среде в течение 48 ч при , фиксируют, дофиксирумт, депадратируют, пропитьшают, заключают и полимери- зуют аналогично примеру 2.

1465740

ранена. На срезах отчетливо выявля ются все ультраструктурные элемент споровых клеток.

Формула изобретени

Способ подготовки бактерий для электронно-микроскопического иссле 10 вания, включакяций фиксацию дегидр тацию, пропитку и заключение в эп сидные смолы с последующей полимер зацией, отличающийся тем, что, с целью сокращения дли- 15 тельности подготовки, фиксацию осу ств.г1яют 3 две стадии - вначале в течение 5-10 мин в смеси следунлцег состава, мас.%:

Глутаральдегид 2,0-2,5 20 Уранилацетат 0,5-0,6

Хлористый кальций 0,11-0,12

Ацет ат-в ероналовый

буфер рН 6,0-6,2 Остальное а затем в течение 50-55 мин после

- f - «j.Jb wt, i jj ( ti 4tiiijnc - JtJ ruin

Ультраструктура вегетативных кле- 25 добавления к указанной смеси 3-4%ток, проспор и спор Вас. spp. шт.-18 качественно сохраняется.

П. р и м е р 9. Бактериальные клетки Bacillus spp. шт.-18 фиксируют, дофиксируют, дегидратируют, пропитывают, заключают и полимеризу- ют аналогично примеру 4.

Структура споровых клеток Вас, spp. шт.-18упрепарированных по предлагаемому способу, качественно сохного водного раствора четырехокиси осмия в соотношении 1:1, пропитку проводят в трех сменах абсолютного спирта и аралдита или пропилено30 ксида и зпона при их соотношении 1-3:3-1 в течение 1,5-2 ч прл 35- 37 с и затем в смоле в течение 1,5- 2 ч в вакууме 133,32 Па при 35-37 С, а полимеризацию осуществля

35 ют в течение 14-16 ч при УО-ЭО С.

1465740

ранена. На срезах отчетливо выявляются все ультраструктурные элементы споровых клеток.

Формула изобретения

Способ подготовки бактерий для электронно-микроскопического исследо- вания, включакяций фиксацию дегидратацию, пропитку и заключение в эпоксидные смолы с последующей полимеризацией, отличающийся тем, что, с целью сокращения дли- тельности подготовки, фиксацию осуще- ств.г1яют 3 две стадии - вначале в течение 5-10 мин в смеси следунлцего состава, мас.%:

Глутаральдегид 2,0-2,5 Уранилацетат 0,5-0,6

Хлористый кальций 0,11-0,12

Ацет ат-в ероналовый

буфер рН 6,0-6,2 Остальное а затем в течение 50-55 мин после

«j.Jb wt, i jj ( ti 4tiiijnc - JtJ ruin

добавления к указанной смеси 3-4%ного водного раствора четырехокиси осмия в соотношении 1:1, пропитку проводят в трех сменах абсолютного спирта и аралдита или пропиленоксида и зпона при их соотношении 1-3:3-1 в течение 1,5-2 ч прл 35- 37 с и затем в смоле в течение 1,5- 2 ч в вакууме 133,32 Па при 35-37 С, а полимеризацию осуществляют в течение 14-16 ч при УО-ЭО С.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к методам электронной микроскопии бактерий.. Целью изобретения является сокращение дли- те 1ьности подготовки бактерий для электронной микроскопии. Фиксацию бактерий осуществляют в течение 5- 10 мин в смеси следующего состава, мас.%: глутаральдегвд 2,0-2,5; урв- нилацетат 0,5-0,6; хлористьй кальций 0,11-0,12; ацетат-вероналовый буфер (рН 6J0-6,2)1 - остальное, затем в течение 50-55 мин после добаапения к указанной смеси 3-4%-ного водного раствора четырехокиси осмия в соотношении 1:1, пропитку проводят в трех сменах абсрлютного спирта и арал- дита или пропиленодссида и эпона при их соотношении (1-3):(3-1) в течение 1,5-2 ч при 35-37°С и затем в смоле в течение 1,5-2 ч в вакууме 133,32 х X Па при 35-37 С. После этого в течение 14-16 ч проводят пол1ме- ризацию при 70-90°С. с (Л