Способ определения внешнесредовых мутагенных воздействий Советский патент 1986 года по МПК C12N15/00 

ел

о: СП, Изобретение относится к медицин в частности к разделу профессионал ной гигиены. Цель изобретения - повьппение то ности определения влияния внешнеср довых мутагенных факторов индивида Способ предусматривает учет сестринских хроматидных обменов (СХО), при этом общий уровень СХО состоит из двух компонентов: внут ренних факторов индивида и внешнесредовьк, который измеряют у данно го индивида на момент забора у него крови,- Эту величину определяют путем добавления БДУ (З-бромдезокс уридина) только в начале культивир вания (на О часу). После одного или нескольких циклов репликации ДНК в отсутствии внешнесредовых воздействий в культуре лимфоцитов исходный уровень внешнесредовых во действий репарируется. При позднем добавлении (БДУ) (на 60 часу культ вирования) фиксируется только исти ный, спонтанный уровень СХО индивид Разница этих двух величин и состав ляет часть СХО, связанную с внешне передовым воздейс.твием. Пример. Обследуют группу .новорожденных и взрослых, контакт рующих с внешнесредовыми воздействиями (лекарственные препараты, курение, алкоголь, выхлопные газы и т.д.). У новорожденных детей кровь берут из пуповины при рождении ребенка, у взрослых - из локтевой вены. Лимфоциты крови культивируют по методу Hanger ford (1965), а именно: к 0,5 мл цельной крови добавляют 1,5 мл сыворотки крупного рогатого скота и 6 мл среды Игла. Для стимуляции лимфоци тов к делению к 8 мл культуры доба ляют 0,02 мл фитоге 1агглютинина (Difсо р) Культуры помещают в термостат (37 С). Для каждого индивида ставят 2 культуры из одного и того же образца крови, взятой из локтевой вены у взрослых (3-5 мл), или крови пуповины (3-5 мл) после отделения новорожденного от плаценты. Впервую культуру БДУ вводят на Очасу культивирования и фиксируютна 72 часу. К этому часу набл даютмаксимальное число клеток 5 П-го деления. Для разных индивидов частота их составляет от 30 до 60% отвсех митозов. Во вторую культуру (которая для предложенного способа является существенным элементом, а не дополнительным вариантом) БДУ добавляют на 60 часу культивирования, когда основная часть клеток проходит одно деление. Клетки второй культуры фиксируют. За 2 ч до фиксации (любого варианта) в культуру добавляют колхицин до конечной концентрации 0,5 мкг/мл, затем культуральную жидкость с клетками (8 мл) помещают .в центрифужные пробирки и центрифугируют в центрифуге ЦЛК-1 6 мин при 1500 об/мин. После этого супернатант удаляют, оставляя над осадком 0,5 МП жидкости. Клетки ресуспендируют, приливают к ним до 10 мл 0,5%-ный раствор хлористого калия, перемешивают и помещают на 6 мин в термостат (37 С). После этого пробирки центрифугируют при указанных режимах. Супернатант удаляют, а клетки ресуспендируют в 0,5 мл оставшейся жидкости. К этой суспензии приливают 6 мл фиксатора, состоящего из 3 частей метанола и 1 части ледяной уксусной кислоты и охлажденного до 0-4 С. После перемешивания пробирки помещают на 15 мин в холодильник, а зятем центрифугируют при прежних режимах, Супернатант удаляют и добавляют свежий фиксатор. Эту продедуру (промывку) проводят 2 раза. После этого суспензию клеток объемом 0,3 мл раскапывают на влажные охлажденные .; стекла и высушивают на воздухе и . Над пламенем горелки, не допуская возгорания метанола. Высушенные в течение 24 ч при препараты окрашивают следующим образом: на 10 мин помещают в водный раствор акридина оранжевого (10 М), промывают водой и высушивают. Затем препараты тонким слоем 0,07 М раствора . и облучают 15 мин ультрафиолетовой лампой СВД-120 А (ДРШ-120). на расстоянии 30-40 см. После облучения препараты промывают в проточной воде и обрабатывают в нак:ыщенном растворе гидроокиси бария при комнатной температуре в течение 5 мин. Препараты

31175165

промывают и высушивают, а затем. (рн 6,8) в течение 10 мин. После окрашивают 2%-ным раствором Гимза, окраски препараты споласкивают водой приготовленным на фосфатном буфере и высушивают.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНЕШНЕСРЕДОВЫХ МУТАГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ, включающий определение в культуре клеток общего уровня, сестринских хроматидных обменов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения влияния внешнесредовых мутагенных факторов на индивида, воздействие мутагеном осуществляют, при условии, если клетки проходят хотя бы одно клеточное деление, за которое происходит репарация повреждений в клетке в виде сестринских хроматидных обменов, получают истинный спонтанный уровень сестринских хроматидных обменов и по разнице между общим и истинным спонтанным уровнем опредеi ляют мутагенные воздействия.