Способ получения препарата инактивированного поверхностного антигена гепатита @ для активной иммунизации Советский патент 1985 года по МПК A61K39/12 

СП

4ib

00 00

Изобретение относится к медицине, преимущественно к приготовлению специфических антигенов, антисывороток и иммунодиагностикумов, и может быть использовано для специфической профилактики вирусного гепатита В.

Целью изобретения является повышение безвредности, стабильности и иммуногенности антигена.

Способ выполняется следующим образом:

На стадии очистки антигена - HBsAg в -предлагаемом способе используют такие простые и недлительные этапы очистки, как прогревание и осаждение полиэтиленгликолем, не требующие применения сложного оборудования и дорогостоящих реактивов, и обеспечивающие высокую степень очистки HBjAg, сопоставимую с величиной, достигаемой в способе-прототипе. Последующая стадия очистки по разработанному способу состоит из двух этапов: обработка материала пепсином, добавление твина-80 и однократное центрифугирование в градиенте сахарозы в стандартном роторе, а в прототипе используют три этапа: обработка пепсином, обработка мочевиной и колоночная хроматография.

На стадии инактивации в качестве инактивирующего агента для обработки очищенного HBsAg используют смесь формальдегида с аминокислотами Е-лейцином или глицином.

В предлагаемом способе инактивирующее воздействие осуществляется двукратно - на стадии очистки HBjAg (этап прогревания исходной плазмы или сыворотки крови) и на стадии обработки очищенного препарата HBsAg смесью формальдегида и аминокислот. Это обеспечивает жесткий режим инактивации инфекциониости и направлено на достижение более полной специфической безвредности целевого продукта. Кроме того, применение инактивирующего воздействия на первом этапе осуществления предлагаемого способа повыщает личную безопасность технического персонала на последующих этапах работы.

На заключительном этапе предлагаемого способа препарат HBjAg после инактивирующей обработки подвергают стерилизующей фильтрации и сорбируют на гидроокиси алюминия. Последнее приводит к усилению иммунногенной активности продукта по сравнению с несорбированным антигеном за счет замедленной ресорбции антигенного материала из создаваемого в тканях реципиента депо.

Пример. Очистка НВД. Исходный материал - 900 мл плазмы крови человеканосителя HBsAg (титр по методу встречного им муноэлектрофореза (ВИЭФ) 1:8, титре

сывороткой, преципитирующей белки сыворотки крови человека - 1:5112), прогревали при температуре 80°С 60 мин сгусток денатурированных белков отделяли центрифугированием при 9000 об/мин в течение 30 мин. К надосадочной жидкости добавляли 50%-ный водный раствор полиэтиленгликоля 6000 до конечной концентрации 15%. Сформировавщийся в течение трех часов осадок отделяли центрифугированием при 9000 об/мин в течение 20 мин и растворяли в 50 мл физиологического раствора хлорида натрия, после чего рН доводили до 2,2 добавлением 1NHC1. К полученной суспензии добавляли пепсин до конечной концентрации 0,01% и смесь инкубировали при 37°С в течение 16 ч. После окончания инкубации к раствору добавляли твин-80 до конечной концентрации 1% и полученную смесь наносили на линейный градиент концентрации сахарозы (10-30%) и центрифугировали при /OOOOXg в течение 12 ч.

Полученный препарат очищенного имел следующие характеристики: объем 60 мл, концентрация белка 50 мкг/мл; титр HBjAg по методу ВИЭФ 1:8, после концентрирования в 10 раз титр с сывороткой, преципитирующий белки человека, равнялся нулю.

Обработка очищенного НВД формальдегидом в смеси с Е-лейцином.

Первоначально готовили 0,264 М раствор

Е-лейцина и 0,0132 М раствор формальдегида (исходный 40%-ный раствор разводили в 855 раз) на стерильном апирогенном изотоническом растворе хлорида натрия рН 6,8. Полученные растворы и препарат очищенного HBsAg смещивали при соотнощении

объемов 1:1:2 (конечная концентрация формальдегида и аминокислоты 0,0033 М и 0,066 М соответственно) и инкубировали при комнатной температуре 72 ч. Затем смесь подвергали стерилизующей фильтрации через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор

0,23 ммк.

Полученный препарат HBjAg имел следующие характеристики: объем 120 мл, концентрация белка 25 мкг/мл, титр HBjAg 1:4. Стабильность инактивированного препарата HBjAg в процессе хранения при -f 4°С представлена в табл. 1.

Таблица 1

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИНАКТИВИРОВАННОГО ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В ДЛЯ АКТИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ путем выделения и очистки антигена из плазмы или сыворотки крови людеи-антигеноносителей и последующей инактивации, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повыщения стабильности и иммуногенности препарата, плазму или сыворотку прогревают, из полученной надосадочной жидкости осаждают антиген полиэтиленгликолем, осадок последовательно обрабатывают пепсином и твином-80 с последующим центрифугированием в градиенте плотности сахарозы и выделением очищенного антигена, который затем обрабатывают смесью формальдегида и Е-лейцина и сорбируют на гидроокиси алюминия. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что прогревание осуществляют при 80°С в течение 60 мин, осаждение полиэтиленглико- сг лем проводят при концентрации 15%, обрабатывают пепсином в концентрации 0,01% сл и твином-80 в концентрации 1%, а смесь 0,ООЗЗМ формальдегида и 0,066М Е-лейцина берут в молярном соотнощении 1:20.

Смесью формальдегида и Е-лей1/8192 1/4096 цина Чистым формальдегидом (по способу1/8192 1/4096 прототипу)

радиоиммунологический метод. активность препарата до инактивирующей обработки; концентрация белка (50 мкг/мл) в 2 раза превышает концентрацию белка в обработанных препаратах.

Сорбция обезвреженного препарата HBjAg на гидроокиси алюминия.

К препарату HBjAg, обработанному формальдегидом в присутствии Е-лейцина, добавляли стерильный гель (А1(ОН)з), содержащий 11 мг/мл основного вещества в изотоническом апирогенном растворе хлорида натрия рН 6,8, из расчета 25 мкг белка на 1 мг сорбента (0,1 мл раствора геля - на 1 мл раствора белка). Смесь инкубировали при комнатной температуре и последующие 48 ч - при +4°С. Полноту сорбции контролировали титрованием HBsAg в надосадочной жидкости после осаждения сорбента. Взвесь адсорбированного антигена разливали в стерильные ампулы в объеме 1 мл и хранили при +4°С.

Оценка иммуногенности конечного продукта.

Различные разведения конечного продукта в объеме 1 мл изотонического раствора хлорида натрия двукратно с интервалом в 2 недели вводили морским свинкам подкожно в область спины. Использовали самцов массой 200-300 г. Максимальный титр анти- HBi отмечали методом ВИЭФ на 4-й неделе от начала иммунизации (табл 2)

Средняя геометрическая

Доза, мкг обратного титра

d.

Сорбирован

Нативный

4,0x1,5

10 20 50

1,6x1,4 7,0x1,4 3,0л1,2 12,1x1,4

Таблица 2

25

Повыщение иммуногенной активности

HBjAg, обработанного формальдегидом в

смеси с Е-лейцином, за счет сорбции на

гидроокиси алюминия выявляли следующим

образом.

Белых мыщей, самцов, массой 18-20 г, иммунизировали различными разведениями HBsAg,сорбированного и несорбированного на гидроокиси алюминия, материал вводили однократно внутрибрющинно, учет результатов методом ВИЭФ проводили через 4 недели от начала иммунизации (табл. 3).

Адсорбция продукта на А1(ОН)з достоверно увеличивала иммуногенную активность (,05).

Таблица 3

Степень сероконверсии

I

Нативньй

Сорбирован

5/5 5/5 5/5 1/4096 1/4096 1/4096 1/4096 1/4096 1/4096 1/2048 1/1024 Оценка безвредности целевого продукта при заражении шимпанзе. Шимпанзе вводили внутримышечно 100 мкг очищенного и инактивированного HBsAg. На протяжении 6 мес. с момента введения препарата у животного не отмечали появления признаков инфекции, вызываемой вирусом гепатита В - антигенемии, повышения уровня трансаминаз и появления антител к внутреннему антигену вируса. Характеристика конечного продукта: объем материала в 1 ампуле 1 мл; растворитель - изотонический раствор 0,9°/о-ного хлорида натрия рН 5,0, 7,0; количество белка, измеренное по методу Лоури, 5-50 мкг; количество гидроокиси алюминия не более 1 мг; количество аминокислот 6,0-13,0 мг концентрация остаточного формальдегида не более 0,003 мг/мл. Препарат стерилен, апирогенен, неинфекционен. Препарат способен индуцировать синтез специфических антител у животных. Препарат не вызывает гепатита В у шимпанзе. Конечный продукт разливается в стерильные ампулы и хранится при 4°С. Необходимость разработки наиболее эффективного средства борьбы с НВ-вирусной инфекцией - вакционного препарата против гепатита В - объясняется тем, что в СССР такой препарат отсутствует. Использование предлагаемого способа получения инактивированного поверхностного антигена гепатита В для активной иммунизации обеспечивает возможность получения высокоочищенного препарата НВД в результате применения простых и нетрудоемких методов очистки при одновременном сокращении длительности процедуры очистки и отказе от использования дорогостоящего и сложного в эксплуатации оборудования, повышение безопасности конечного продукта за счет использования двух этапов инактивирующего воздействия и применения более сильного и эффективного инактивирующего агента-аминометилольного производного формальдегида, повышение стабильности и иммуногенности конечного продукта в результате использования аминометилольного производного формальдегида и применения сорбента-адъюванта и повышение личной безопасности технического персонала в процессе работы за счет применения инактивирующего воздействия на первом этапе очистки HBjAg.