Способ получения поверхностного антигена гепатита В из плазмы крови человека Советский патент 1988 года по МПК A61B10/00 A61K39/00 

(21)3454639/28-14

(22)09.06.82

(31)Р-231588

(32)10.06.81

(33)PL

(46) 07.07.88. Бюл. 25

(71)Акадэмия Мэдычна (PL)

(72)Витольд Бжоско, Петр Яниски, Збигнев Класковски, Казимеж Мадалинь- ски и Анджей Донброва (PL)

(53) 615.373 (088.8) (56) Eveline Е. Reerink et al. Viral jHepatitis Jut. Symposium, edt. by Franklin Just. liess.. Sect V , 1981, 437-450.

(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, включающий делипиди- зацию и предварительное удаление белков плазмы путем обработки полиэти-f ленгликолем, отличающий- с я тем, что, с целью повышения чистоты конечного продукта, после делипидизации и предварительного удаления белков плазмы,исходный продукт обрабатывают пепсином в количестве 0,01-0,5 мг/мг белка, далее фильтруют на молекулярном фильтре, позволяющем прохождение частиц до 100000 даль- тон в фосфатно-буферной среде при рН 7,1-7,3, и дезактивируют формальдегидом в количестве 1:2000 объем/ объем в течение 96 ч.

§

СО

о

to

см

Изобретение относится к получению чистого поверхностного антигена гепатита В (HBsAg) из плазмы крови челот века и может быть использовано для получения HBS-антител при лечении.

Целью изобретения яв-.яется повышение чистоты конечного продукта.

Способ осуществляется следующим образом.

На первой стадии проводят делипи- дизацию плазмы крови человека. Для этого к 1000 МП плазмы, полученной от доноров HBsAg, имеющей титр согласно определению методом иммуно- злектроосмоосаждения (IEOP) минимально 1:10, прибавляют 100 мл 0,1 мол ,0.

После прибавления хлористого марганца плазму перемешивают в электро- магнитном смесительном устройстве при температуре ледяной бани в течение I ч. Затем материал центрифугируют в течение 30 мин при скорости 6000 1/мин. После центрифугирова- ния отбрасывают осадок, не содержащий HBsAg. Слой жидкости, полученный в результате центрифугирования, доводят до рН 5,6, применяя 0,1н.НС1, и прибавляют полиэтилен- гликоль 6000 (PEG 6000) в количестве 75 г на 1000 мл материала. Затем материал перемешивают в течение 12 ч при 4 С в электромагнитном перемащивающем устройстве. Материал выгружают ,из смесителя и центрифугируют 30 мин при скорости 6000 1/мин.Спой жидкости, не содержащий антигенов, отбрасывают и для последующей обр а- ботки собирают осадок, полученный в результате центрифугирования.

Этот осадок растворяют в 200 мл 0,9 М NaCl и раствор разбавляют де- ионизирова1шой водой до объема, кото р.1й равен объему материала перед центрифугированием. После прибавления NaCl осадок переходит снова в раствор. Этот раствор еще раз подвергают центрифугированию 30 мин со скоростью 600 1/мин. После центрифугирования слой жидкости, содержащий HBs антиген, собирают, остаток, не содержащий его, отбрасывают. Прибавлением деионизированной воды объем слоя жидкости доводят до 10 000 МП. Небольшое количество остатка, оставшегося после разбавления, удаляют центрифугированием в тчение 30 мин при скорости 6000

0 g

с

5

0

1/мин. На последующей стадии процесса получения антигена применяют спой жидкости, получивщийся в результате этого центрифугирования.

Материал, полученный в ходе дели- пидизации, подвергают перевариванию с ферментом. Дпя этого 1000 мп материала нагревают до температуры около 37°С устанавливают прибавлением 1н. НСI рН 2,5. К полученному таким образом материалу прибавляют пепсин сигма, несколько раз кристаллизуют в количестве около 0,05 мг на 1 мг белкового раствора. Содержание белков в растворе определяют спектрофотомет- рическим методом. Через 1 ч переваривания с пепсином его прерывают путем установления рН раствора 4,6 действием 1н. NaOH. После завершения переваривания раствор центрифугируют 30 мин со скоростью 6000 1/мин. В осадке-, образовавщемся после центрифугирования, HBsAg не обнаруживается, поскольку он полностью переходит в слой жидкости.

Переваривание с пепсином вызывает расщепление белков плазмы человеческой крови до полипептидных единиц, размер которых не превьшает 30000 дальтон. Однако белок HBsAg не подвергается перевариванию.

Затем следует стадия очистки материала от белков плазмы, переваренных с пепсином, при помощи молекулярной фильтрации на фильтрах, пропускающих частицы величиною до 100000 даль- тон. Дпя этого может применяться система фильтров с замкнутым циклом производства Ami con Company (США), в которой материал, подлежаи(ий фильт-. рации, многократно фильтруют через зону фильтрации, где частицы отделяют- ся от раствора при помощи молекулярных фильтров с размером, меньше, чем предел фильтрации. Согласно предпа- гаемому способу применяют фильтрацию через фильтры типа HI«100, позволяющие проход частиц величиною до ЮОООО дальтон. Полный цикл фильтрации заключается в 9-кратном прокачивании материала в объеме 80 л при давлении 0,63 атм. Материал перед подачей в фильтрующую систему разбавляют до указанного объема фосфатным буфером на основе деионизированной не вызывающей лихорадки воды с рН 7,1-7,3. Такая вода может быть

3

получена на аппаратуре, выпускаемой фирмой EIGA Company (Великобритания)

В ходе фильтрации происходит полное вымывание белков плазмы, которые были предварительно переварены с пепсином. Материал, полученный из фильтрационной систе, содержащий очищенный HBsAg, помещают порциями по 10000 мл в холодильник на 96 ч, при- баоив формальдегид в количестве, необходимом для создания его концентрации в растворе 1:2000 по объему. После того, как раствор вынут из холодильника, формальдегид удаляют из материала при помощи дедиализации. Затем проводят адсорбцию HBsAg на гидроокиси алюминия, прибавляемой в количестве 1 мг на I мл раствора. Готовый продукт, полученный таким об разом, помещают в ампулы.

Затем анализируют его на присутствие в нем белков плазмы крови человека методом двойной диффузии в агаре, при этом не обнаруживается линий осаждения при 30-кратиом разбавлении плазмой антипротеинов человека. Он также не содержит инфекционных частиц вируса гепатита В.

Пример 1. От донора HBsAg плазму собирают при помощи плазмофо реза. Активность HBsAg определяют методом иммуноэлектроосмофореза с титром, не ниже чем 1:16. Плазму крови человека подвергают процессу делипидизации путем прибавления , в расчете на I л плазмы I л I М и 150000 международных единиц гепарина в объеме 30 мл. Этот материал инкубируют при комнатной темпе- ратуре в электромагнитном перемещи- вакицем устройстве в течение 30 мин. По истечении этого времени весь материал центрифугируют на центрифуге типа Бекман S-6 с мотором SA-10 при скорости 6000 1/мин в течение 30 мин Полученный остаток, представляющий собой HBsAg (-), отбрасывают, слой жидкости собирают в колбу вместимостью 2 л.

К продукту прибавляют то же количество 7,5%-ного раствора полиэтилен гликоля с молекулярной массой 6000. Устанавливают рН среды рарным 5,5 при помощи iH.HCl. Продукт помещают в холодильник и инкубируют ночь при постоянном перемешивании.

На следующий день центрифугируют на центрифуге Бехман с мотором

JQ 15 20

25

30 Q д5

35

50

5

121

JA-100 при 600 1/M1IH. Слой жидкости, являющийся HBsAg, (-), отбрасывают, остаток растворяют в 200 мл 0,9%-ио-- го NaCl и разбавляют деионизирован-- ной водой до объема 2 л. Через 20-30 мин обильный осадок удаляют центрифугированием в течение 30 мин на центрифуге Бекман J-6 с мотором JA-10 при скорости 6000 1/мин.

Полученный прозрачный фильтрат имеет активность HBsAg согласно определению методом иммуноэлектроосмофореза с титром 1:8. Объем раствора увеличивают до 10 л разбавлением деионизированной воды (2 л + 8 л деионизационной воды). Через 30 мин наблюдается небольшое количество осадка, который удаляют центрифугированием на центрифуге Бекман J-6 с мотором JA-10 при скорости 6000 1/мин в течение 30 мин. Получают прозрачный слой жидкости с титром около 1:2 согласно тесту на иммуноэлектроосмоосаждение.

К 10 л жидкости прибавляют 90 г NaC1, получая 0,9%-ный раствор NaCl.

Продукт, полученный таким образом, инкубируют при 37°С в течение 12 ч. По истечении этого времени к жидкости при 37 с и при рН 2,5 прибавляют пепсин в количестве 0,01 мг на 1 мг белков. Переваривание пепсина с продуктом производят 1 ч при 37°С. Через 1 ч переваривание прекращают путем прибавления 0,1 н. NaOH до установления рН до 3,5.

Оставшийся осадок центрифугируют в течение 20 мин на центрифуге Бекман J-6 с мотором JA-10 при 6000 1/мин и затем осадок отбрасывают.

Слой жидкости подвергают молекулярной фильтрации в аппарате ДС 30 Amicon Company с применением полого волокнистого фильтра Н 10 100. Фильтрацию ведут в среде фосфатного буфера с рН 7,1.

Получают в результате молекулярной фильтрации материал объемом 10 л, титр при определении методом иммуноэлектроосмоосаждения HBsAg 1:2. Этот материал при 100-кратном разбавлении не показывает линий осаждения по технологии иммунодиффузии с применением плазмы крови животных анти- IgG, анти-IgM, анти-IgA, анти-протеи- нов человека и плазмы антипротеинов человека. Антиген, очищенный от про51

I f-iiHoa lГIaз 5 l,инaктивиpoяaн формальдегидом н течение 96 ч р количестве i:2000 по объему.

вакцинация лабораторных животных таких как морские свинки или кролики с 100--кратным разбавлением материала не дает им туногенноУ1 реакции против заражения препарата белком, происходящим из плазмы крови человека. Полу чается только одна линия осаждения с материалом, содержащим HBsAg.

Материал, полученный предлагаемым способом, является сильно иммуноген- ным, что доказано при вакцинации шим панзе-и 10 человек.

Химические характеристики вакцины для вирусного гепатита В:

HBsAg, мм/см 0,5 Общий белок,

мм/см 0,5

Полипептиды, мм/см0,02

Молекулярный вес30000

NaCl, %0,85

g

0

5

216

1 идроокись алюминия, мг/см 1

Мертиолат,мм/смЗ100

В материале не присутствует HBsAg, HBsAg и DNA полимераэа, что доказано с применением третьего поколения тестов.

Пример 2. Исходный материал обрабатывают по способу примера 1, используя для разложения белков большее количество пепсина, т.е. 0,5 мг пепсина на 1 мг белков при . Далее полученный продукт фильтруют на молекулярном фильтре, как в примере 1, при этом используют фосфатио-буфер- иую среду с рН 7,3 и дезактивируют формальдегидом в количестве 1:2000 по объему в течение 96 ч. Необходимую концентрацию формальдегида получают добавлением 150 см 4%-ного раствора формалина к 10 дм фильтрата.

Предложенный способ позволяет повысить чистоту HBsAg до 100% (по известному 15%).