Способ определения активности клеточного иммунитета Советский патент 1985 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медицине а именно к иммунологии, и может быт использовано для оценки состояния клеточного иммунитета у больных с различными инфекционными заболеваниями. Цель изобретения - повышение точ ности и ускорение способа. Способ осуществляют следующим образом. Производят забор крови у больног в количестве 15-20 мл на гепарине (20 ЕЛ в 1 мл). Из полученной крови вьщеляют лимфоциты путем фракционирования на одном из общеупотребляемых градиентов плотности. Лимфоциты трижды отмывают в растворе Хэнкеа с 20% гидролизата лактальбумина (цент рифугирование при 100 и в течение 5-10 мин) и суспендируют в среде культивирования в концентрации О,5-1О в 1 мл. Полученную взвесь до использования хранят при 0-4 С. Для получения клеток-мишеней про изводят забор крови у здорового чел века 01 группы в количестве 15-20 м на цинтроглюкофосфате. К половине объема этой крови добавляют взвесь бактерий - возбудителей заболеваний убитых прогреванием при температуре губительно действующей на данные микроорганизмы. К остальной части крови добавляют взвесь убитых таким же образом сапрофитных бактерий, ко торые используются в качестве контрольных антигенов. При выборе контрольных антигенов руководствуются отсутствием сенсибилизации организма человека к этим бактериям и принадлежностью их к тому же семейству что и возбудитель заболевания. Взве убитых бактерий добавляют к крови в конечной концентрации 0,5-1-10 в 1 мл. Кровь с бактериями инкубируют в течение 20-30 мин при . После этого для остановки фагоцитоза добавляют колхицин до конечной концентрации 20-25 мкг в 1 мл и продол жают инкубацию в тех же условиях в течение того же времени. Затем из крови с возбудителями заболевания и с бактериями - контрольными антигенами выделяют гранулоциты. Для этог осаждают эритроциты добавлением же латина до конечной концентрации 0,8-1% и инкубагшей при 37°С в течение 20 мин, а полученную плазму 012 с лейкоцитами фракционируют на том же градиенте плотности, KOTopbrii используется для вьщеления лимфоцитов. Выделенные гранулоциты обрабатывают 0,84%-ным раствором хлорида аммония для разрушения оставшихся эритроцитов, трижды отмывают в растворе Хэнкса с 20% гидролизата лактальбумина и суспендируют в среде культивирования в конечной концентрации 0,5-1 -10 в 1 мл. Культивирование клеток производят в среде 199, содержащей 20% гидролизата лактальбумина, 10% инактивированной нормальной человеческой сыворотки АВ 1У группы крови без следов гемолиза, пенициллин 100 ЕД и стрептомицин 100 мкг в 1 мл. К 1 мл взвеси лимфоцитов больного добавляют 1 мл взвеси гранулоцитов здорового человека, незавершенно профагоцитировавших бактерий возбудители заболевания. В качестве контроля к 1 мл взвеси тех же лимфоцитов добавляют 1 мл взвеси тех же гранулоцитов, незавершенно профагоцитировавших бактерий - контрольные антигены. Пог-шмо опытных и контрольных проб производят культивирование отдельно взятых гранулоцитов, профагоцитировавших возбудителей заболевания или контрольные антигены с добавлением равных объемов среды культивирования для определения степени спонтанного лизиса клеток-мишеней. Для оценки полного лизиса клетокмишеней гранулоциты, профагоцитировавшие опытные или контрольные антигены, помещают в соответствующих концентрациях в дистиллированную воИнкубацию проб производят в пенициллиновых флаконах при 37°С в газовой среде, состоящей из 5% углекислого газа и 95% атмосферного воздуха. Все манипуляции проводят с соблюдением стерильности. Через 4-5 ч производят центрифугирование проб при 100 g в течение 10-15 мин и в надосадочной жидкости определяют пероксидазную активность. Для этого готовится 0,1 %-ньй раствор солянокислого бензидина в ацетатном буфере (рН 4,6) и 3%-ный раствор перекиси водорода в дистиллированной воде. К 2 мл раствора бензидина добавляют 0,1 мл раствора Н202 и мл надосадочной жидкости культур. Через 2-3 мин разви31

вается голубая окраска, интенсивность которой оценивают фотоэлектроколоримехрически или спектрофотометрически.

На основании полученных данных вычисляют количество клеток-мишеней, разрушенных в опытных и контрольных; пробах, с учетом спонтанного лизиса и по отношению к показателям полного лизиса мишеней (А) по формуле

Е

100%,

Е.

где Е - показатель пероксидазной

активности в пробах с опытными или контрольными клетками-мишенями и лимфоцитами больного; Eg - показатель пероксидазной

активности в пробах с изолированными опытными или контрольными клеткамимишенями;

Е, - показатель цитотоксической активности в пробах с полным разрушением опытных или контрольных клетокмишеней.

Цитотоксическую активность лимфоцитов больного по отношению к возбудителю заболевания оценивают по разнице между показателями лизиса клеток-мишеней в опытных пробах и аналогичным показателем контрольных проб. Выполнение способа занимает не более 8-9 ч.

Цитотоксическая активность лимфоцитов, определяемая предлагаемым

Время инкубации,

ч

800014

способом, отражает степень сенстчбилиз ции цитотоксических лимфоцитов антигенным комплексом возбудителей

заболевания и их способность разрушать клетки-мишени, содержащие возбудитель, т.е. по данному показателю оцениваются протективные свойства клеточного иммунитета по отношению к возбудителю и в целом - ак10 тивносгь его при данном заболевании. Пример 1. Определение активности клеточного иммунитета по цитотоксическому действию лимфоцитов производят у здоровых людей по отношению к патогенному стафилококку (Штамм Byyg-46) .

В качестве контрольного антигена используют-сапрофитного представителя того же семейства Micrococcus lysodeicticus (штамм 2665). Взвесь 0 стафилококков и микрококков прогревают при 60 С в течение 30-35 мин и добавляют к крови в конечной концентрации Г10.

5 ЛиГфоциты получают из крови здоровых людей - доноров крови, клеткимишени получают также из крови здоровых людей 01 группы. Культивирование опытных и контрольных проб, а

Q также отдельно взятых клеток-мишеней производят при 37 С в соответствующей газовой среде в течение 3,4,5,8 и 16 ч. Показатели цитотоксической активности лимфоцитов здоровых людей по отношению к патогенному стафилококку, определяемые в различные сроки культивирования, представлены . в таблице.

16

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА путем выявления цитотоксического действия сенсибилизированных лимАоцитов на клетки-мишени, отличающийся тем, что, с целью повьпиения точности и ускорения способа, в качестве клеток-мишеней используют гранулоциты после их контакта с убитыми бактериальными клетками, а цитотоксическое действие лимфоцитов выявляют по наличию миелопероксидазы и при увеличении или снижении ее содержания относительно нормы определяют повышение или снижение активности клеточного иммунитета соответственно.

Показатель цитотоксической ак12,4+3,5 тивности, %

Как видно из таблицы, показатель цитотоксической активности достигает максиму через 4 ч инкубации лимфоцитов с клетками-мишенями и в последующие сроки культивирования держится на том же уровне. Следовательно, в предлагаемом способе время инкубации 4-5 ч определяется оптимальным для максимального разру50 шения клеток-мишеней под,действием цитотоксических лимфоцитов.

Пример 2. Определение цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к патогенному стафилококку производят у больных с абсце ДИРУЮ1ЦИМИ пневмониями стафилококко: вой :#тиологии, подтвержденной бак;териологически. Определение указан23,12+2,1 21,4+2,5 22,2+2,3 19,3+3,6 ного показателя производят аналогич но примеру 1. Больной К. Диагноз: правосторонняя верхнедолевая абсцедирующая пневмония. В пробах с опытным антигеном: Е 0,113, Е2 0,036, ЕЗ 0,380. АОП .(О,113-0,035):О,380 100% - 20,6%. В пробах с контрольным антигеном Е, 0,05, ЕЗ 0,032, ЕЗ 0,360. А. (0,05-0,П32):0,36 100% 5,1% - А 20,6% - 5,1% 14,5%. Показатель цитотоксической актив ности лимфоцитов по отношению к стафилококку составляет 14,5%. Больной Н. Диагноз: правосторонняя верхнедолевая абсцедирующая пневмония. Клиническое течение хара теризуется быстрой в течение 5 дн. нормячизацией температуры тела, пре кращением отделения мокроты в тот ж срок, быстрым уменьшением воспалительной инфильтрации и уменьшением размеров полости, выявляемых рентге нологически . В пробах с опытным антигеном: Е . 0,223, EZ 0,048, Е, 0,410. АО„ (0,223-0,048): 0,41 100% 42,8%. В пробах с контрольным антигеном Е, 0,060, ЕЗ 0,049, Е, 0,430. А (О,060-0,049):0,430 100% 2,5%. Адп - А. 42,8% - 2,5% 40.3%. Показатель цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к стафилококку у больного увеличен до 40,3%. Приведенные примеры свидетельствуют о том, что у больного с неблагоприятным течением заболевания набл дается снижение цитотоксической активности лимфоцитов по сравнению со здоровыми людьми и интенсивность зтого снижения отражает степень тяжести заболевания. Благоприятное течение заболевания сопровождается повьшением цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к стафилококку. Проведение параллельных определений цитотоксической активности лимфоцитов здоровых людей и больных хроническим тонзилитом предлагаемым и известным способами по отношению к гемолитическому стрептококку или его аллергену (растворимому антигену) позволяет заключить, что предложенный способ обладает более высокой точностью в сравнении с известным. В частности, с помощью предлагаемого способа удается выявить более глубокие изменения цитотоксической активности лимфоцитов по отношению к гемолитическому стрептококку в 66,6+ 12,4% случаев, а степень повьш1ения точности в сравнении с известным составляет 31,6+11,2%.,. Постановка реакции занимает всего 4-5 ч.