Способ определения цитотоксического эффекта лимфоцитов крови Советский патент 1983 года по МПК A61B10/00 

ел

Иаобретение относится к медицине а именно к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клинической и экспериментальной медицины для диагностики инфекционной, лекарственной и других форм аллергии.

Известен способ определения цитотоксического эффекта лимфоцитов крови для выявления состояния иммунного ответа организма путем взаимодействия Т-лимфоцитов с клеткамимишенями . в Качестве последних применяют монослой опухолевых клеток фибробласты, эритроциты цыплят или голубей, ;р1я учета повреждений клег ток-мишеней используют подсчет клеток в гемоцитометре С

Однако данный способ сложен в исполнении, поскольку требует специальной подготовки клеток-мишеней и большого количества лимфоцитов.

Наиболее близок к предлагаемому способ определения цитотокси«1еского эффекта лимфоцитов крови путем добавления лимфоцитов к клеткам-мишеням с последующим определением цитотоксического действия по индексу лигзиса клеток-мишеней. Причем в качестве клеток-мишене й используют эритроциты барана, нагруженные антигеном, а учет реакции осуществляют на фотоэлектрокалориметре и pac-f чет индекса лизиса ведут по формуле а-5, где а и 6 - оптические плотное 5

ти проб с сенсибилизированными антигенами-эритроцитами и кoнтpoльны /Iи эритроцитами Сз .

Однако известный способ недостаточно чувствителен, поскольку диапазон измерения степени лизиса эритроцитов на фотоэлектрокалориметре ограничен за счет оптических свойств кювет и прибора. В 10% случаев может давать неспецифические реакции. Кроме того, он сложен в исполнении, так как эритроциты барана требуют специальной обработки и специального консерванта.

Цель изобретения - упрощение и повышение чувствительности способа.

Указанная цель достигается тем, .что согласно способу определения цитотоксического эффекта лимфоцитов .Крови путем добавления лимфоцитов к клеткам-мишеням с последующим определением цитотоксического действия по индексу лизиса клеток-мишеней в качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты.больного, причем учет реакции осуществляаот в капиллярах, а индекс лизиса определяют по отношению высодгы столбико в сенсибилизированных эритроцитов к высоте стол-; биков контрольных эритроцитов.

Способ осуществляют следующит/ образом.

Получают 5-10 мл крови больного, отстаивают ее 30-40 мин при , отделяют верхний слой плазмы вместе с лейкоцитами, отмывают центрифугированием лейкоциты от плазмы, центрифугируют оставшуюся после отделения лейкоцитов кровь для получения осадка эритроцитов, отмывают их от следов плазмы, приготавливают 10%-ную взвесь зритроцитоа, соединяют их с исследуемь 4 антигеном, инкубируют 1 ч при З7с, отг/1ывают эритроциты центрифугированием от несвязавшегося антигена, соединяют взвесь сенсибилизированных эритроцитов с лейкоцитами и инкубируют 18-24 ч при . Учет степени лизиса эритроцитов осуществляют путем заполнения взвесью капилляров, запаивания их с одного конца, центрифугирования для получения осадков эритроцитов, измерения их высоты в миллиметрах и вычисления индекса лизиса эритроцитов по формуА

ле -, где А и Б - средняя высота ь

столбиков.сенсибилизированных и контрольных эритроцитов соответственно.

Следует отметить, что реакцию эритроцитов с лейкоцитами ставят в соотношении 8/1-10/1 соответственно и осуществляют в среде с 10-20% аутосыворотки. Выяснена также способность аутоэритроцитов адсорбировать на себя антигены при инкубации in vitro. Указанное выше соотношение является оптимальным для учета степени лизиса эритроцитов в капиллярах и получения столбиков эритроцитов высотой ,0,5-3,0 глм. При других соотношениях эритроцитов и лейкоцитов столбик эритроцитов или совсем отсутствует, или получается столь незначительным, что его невозможно измерить в капиллярах. Кроме того, выявлена возможность использования аутосыворотки (10-20%) в инкубационной среде взамен сыворотки крупного рогатого скота. Указанный процент сыворотки в среде является существенным моментом, так как при большей ее концентрации проявляется действие антител на ход реакции.

Способ испытан, на модели туберкулезной инфекции.

.Нз вены больного туберкулезом берут 5-10 MJi крови с гепарином 25 ед/мл, отстаивают 30-40 мин при , отделяют верхний слой плазмы с лейкоцитами, центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин, плазму отделяют центрифугированием и используют в дальнейшем для приготовления среды 199 с 20% аутосыворотки. При наличии примеси эритроцитов в осадке лейкоцитов их лизируют следующим образом: к осадку клеток добавляют 5 мл 0,35%-ной NaCl, осторожно пере5 2 мешивают пипеткой 30 с, добавляют 0,6 мл 5%-ного раствора NaCl, центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин, а затем отмывают осадок два раза средой 199. Отмытые лейкоциты суспендируют в 0,8 мл среды 199 с 20% аутосыворотки и хранят на холоде (лри плюс ) до использования в реакции Для приготовления сенсибилизированных к антигену аутоэритроцитов кровь после отделения слоя лейкоцитов центри фугируют при 1000 об/мин 10 мин, осадок эритроцитов отмывают два раза О,9%-ным раствором NaCl по 5 мл. Готовят 10%-ную взвесь эритроцитов,разливают по 0,2 мл в четЕфе полистироловые микропробирки (Эппендорфа или другого типа), добавляют антигены по 0,1 мл в первые три пробирки, а в четвертую - 0,9%-нун) NaCl (контроль) В качестве антигенов используют туберкулин (в ампулу с сухим антигеном добавляют 1 мл 0,9%-ной NaCl и затем разводят в сортношении 1:10 0;9%-ным раствором NaCl), кокцидиоидин и гистоплазмин (100 мкг/мп). Инкубируют эритроциты с антигеном в течение 1 ч при 37с, затем отмывают два раза 0,9%-ной NaCl путем центрифугирования V, при 1000 об/мин. К осадкам эритроцитов добавляют по 0,2 мл среды 199 с 20% аутосыворотки и затем по 6,2 мл взвеси лейкоцитов. Пробирки встряхивают и инкубируют 18-24 ч при З7с. Учет степени лизиса эритроцитов проводят следующим образом: из каждой пробирки набирают микропипеткой по 10 мкл клеточной смеси в стеклянные капилля длиной 40 мм и внутренним диаметром 0,7-0,9 мм. Диаметр капилляров предварительно стандартизируют для данного опыта с помощью иглы для подкожных инъекций. Один конец капилляра запаивают пластилином, центрифугируют .при об/мин 5 мин, монтируют их по 5 штук на предметном стекле лейкопластырем и затем измеряют в миллиметрах высоту столбика эритроцитов с помощью окулярной лупы 10 . Степень цитотоксического эффекта лейкоцитов по отношению к сенсибилизированным эритроцитам (рольного определяют по вышепри1веденной формуле. В табл.1 приведены результаты сятределения сенсибилизации к туберкулину с помощью Цмтотоксической реакц1Ш по предлагаемому способу. 7 а б л и Ц а 1

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ;Путем добавления лимфоцитов к клеткaм- шшeням с последующим определением цитотоксического действия .по индексу лизиса клеток-мишеней,о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с це-. лью упрощения и- повЕЛоения чувствие тельности способа, в качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты больного, причем учет реакции осуществляют в. капиллярах, а индекс лизиса определяют по отношению высоты столбиков сенсибилизированных эритроцитов к высоте столбиков конт- . рольных эритроцитов.

1,3 1,2 2,6

1,2

2,6 2,4

Среднее 2,37

Из таблицы видно, что в случае положительной цитотоксической реак- ции высота столбиков сенсибилизированных аутоэритроцитов в капиллярах составляет в среднем 1,2 мм,йесенсибилизировамных - 2,6 а индекс лизиса эритроцитов - 0,52.

Для проверки специфичности цито-. токсической реакции применяют также тест-блокгщы цитотоксического действия лимфоцитов. Для этого выделенные из крови больного с активнЕЖ

2,6 2,5 U2 0,52

л,ь

. 2,2

2,2 Среднее 2,30

туберкулезом лейкоциты инкубируют .с аитигеном (к 10 клеток добавляют 100 мкг туберкулина) в течение 18 ч при 37°С, отмывают от несвязавшегося антигена центрифугированием,соединяют с аутоэритроцитами больного, сенсибилизированными туберкулином, и определяют индекс из лизиса по предлагаемому способу.

ff табл.2 приведены результаты определения блокады цитотоксического действия лейкоцитов на клетки-мишени.

Лейкоциты Высота столбт ов эритроцитов, ммИндекс лиот больного т.зиса эриттуберкуле- сенсибилизированных к несенсибилизированных к роцитов зом в актив- туберкулинутуберкулину

ной форме

До инкуба.ции с туберкулином 1,1 0,9 1,1 2,0 2,1 2,3

0,9 1,0 - 2,4 2,0 - 0,43 Среднее 0,9Среднее 2,1 После инкубации с туберкулином 1,9 1,8 2,0 2,1 2,2 2,2

1,9 2,0 - 2,2 2,1 . 0,87 Среднее 1,9 Среднее 2,18

--------- ----------------------- ---- «.--------- --- --«---- - --

Из таблицы следует, что после ин-jg сенсибилизации: в 10% случаев

кубациилейкоцитов больного с тубер-возможность дополнительного обнарукулином происходит блокада цитоток-жения лиц с сенсибилизацией к туберсического действия лимфоцитов накулину в группе с активным туберкуклетки-мишени.леэом, в 15% - в группе больных с

Таким образом, цитотоксическое с неактивным туберкулезом и в 5% - средействие лимфоцитов больных туберку- , ди здоровых лиц. Это позволяет прилез ом на аутоэритроциты, нагружен-менять предлагаемый способ для оценные туберкулином, имеет иммунологи-ки степени извлеченности больных от ческую природу и обусловлено сенси-инфекции.

билизацией лимфоцитов к антигенамв табл.3 приведены .результаты

возбудителя туберкулеза. выявления цитотоксического эффекта

Предлагаемый способ по сравнению jлимфоцитов крови у больных туберкус известным позволяет достичь боль-лезом по сравнению со здоровыми дошей чувствительности определениянорами. Количество Диагноз обследованных лиц

Гистоплазмин

Активный туберкулез 15

Неактивный туберкулез

Здоровые доноры I Примечание. - число лиц с

Таблица 2

/

jf5 Iт а .6 л и ц а 3 :

ТуберГистоКокцикулин

плаздиоимин

дин

13

2 1

2 1 цитотоксический эффект лимфоцитов в способе предлагаемом известном положительной реакцией. 7 . 105 Как следует из таблицы, предла- гаеьолй способ позволяет выявить сенсибилизацию к туберкулину у двух больных с неактивным туберкулезом и у одного здорового донора. При клиНико-рентгенологическом обследовании у них подтвердилось наличие активации туберкулезного процесса. Исследование цитотоксического эффекта лимфоцитов с гетерологичными аллергенсц и кокцидиоидином и гистоплазмином показало специфичность предлагаемого способа (отсутствие реакцяи у всех обследованных), в то время как известный способ вызывал иногда 17 появление неспецифических реакций с указанными аллергенами, сенсибили зация к которым у больных и здоровых лиц отсутствует, Такшл образом, предлагаемый способ обладает большей чувствительностью определения сенсибилизации организма и позволяет точнее осуществлять .диагностику, например туберкулеза, -Кроме того, способ прост и достоверен, так как не требует специальных приборов, реагентов и позволяет одновременно проводить пять и более повторностей.