Способ получения ферментного фотографического материала и способ получения изображения на нем Советский патент 1985 года по МПК G03C1/72 

Изобретение относится к бессереб ряной фотографии, точнее к фотомэтериалам для получения полутоновых черно-белых и окрашенных изображений. Цель изобретения - удешевление фотоматериала, повышение его светочувствительности и качества изображения. Способ получения ферментного фотографического материала осуществля ется следующим образом. Приготавливают полимерный- листовой материал, несущий светочувствительные реакционноспособные группы. Для этого полимерную подложку, например целлюлозу, карбоксиметил- целлюлозу, фосфоцеллюлозу, желатину или карбоксиметилсефадекс, модифицируют бифункциональными фотореаген тами с помощью реакций алкилирования или ацилирования. В качестве би функциональных фотореагентов исполь зуют ( ароматические азиды, содержаши л-хлорэтиламиногруппы, карбоксильные амино- и другие реакционноспособные группы, модифицирующие по лимерную подложку. Наносят на подложку раствор активного фермента, например щелочной фосфотазы, лактатдегидрогеназы, пер оксидазы, субтилизина, о -химотрипси на и др. (предварительно раствор фе мента фильтруют через полимерный но ситель для удаления сильно сорбирующихся агрегатов )и высушивают. Способ получения изображения ; на полученном, как описано, вьше фо томатериале осуществляется следующим образом. Фотоматериал экспонируют через г логеносеребряный полутоновьш негати или через трафарет с помощью ртутных ламп ДРШ-500 или БУФ-15. В результате фоторазложения ароматических азидов с образованием высокореакциоиноспособных нитренов в экспонированных участках фермент ковален .но и неспецифично, т.е. не по актив ному центру, присоединяется к полимерной матрице без заметного уменьшения своей каталитической активнос ти. Закрепляют скрытое изображение вымьшаннем несвязанного фермента, например обрабатывают буферным раст вором с больщой ионной силой, содержащим поверхностно-активные веA2щества, например 0,1 М НС1, 1 М NaCl и Тритон Х-100. В результате ковалентло не связанный фермент переходит в раствор и на подложке образу- ется стабильное скрытое изображение, состоящее из фотоиммобилизованного фермента. Проявляют скрытое изображение методами гистохимической визуализации ферментов, т.е. обрабатывагот водными растворами хромогенных: субстратов, специфичных для данного фермента, например oi-нёфтилфосфат для фосфотазы, Н202 с о-дианизидином для пероксидазы, индоксилбутират для субтилизина и др. В результате ферментативных реакций в местонахождении последнего происходит накопление красителя, что и приводит к образованию видимого изображения. Предлагаемьй способ применим к ферментам практически всех классов, поскольку в указанных условиях к подложке ковалентно присоединяются любые белки, находящиеся на полимерном нрсителе. Это определяется способностью ароматических азидов при облучении УФ-светом давать высокореакционноспособные частицы - нитре- ны, способные модифицировать практически все типы химических связей, причем квантовый выход фотолиза ароматических азидов в полосе поглощения близок к единице. Выбор под- ложек с ковалентно присоединенными азидогруппами весьма широк. Многообразие, методов гистохимической визуализации каталитически ак- тивньпс ферментов позволяет получать изображение любого цвета, в том числе и черно-белое. Другими достоинствами предлагаемых способов являются легкость получения полутонового изображения и возможность использования ферментативных препара- тов низкой степени очистки, что значительно снижает стоимость фотоматериала. Изобретение иллюстрируется примерами с ферментами классов гидролаз и оксидоредуктаз. Во всех примерах, если это специально не оговорено в тексте, растворитель - вода, темпе- ратура комнатная (20-25 С). Пример I , а) Получение светочувствительного полимерного материала. ферментативной реакции с солями ди азония при комнатной температуре О, I- ч в растворе, содержащем: ot-Нафтилфосфат натрия, мг5 Диазоль синий 2 С, мг12 1 М трис: НС1, 1 М NaC1, 1 Ш MgClj, ZnCL , рН 9,6, После проявления получают черно белое изображение, которое многокр но промывают водой и сушат. Пример 3. а)Получение полимерного светочувствительного материала. Светочувствительную карбоксимет целлюлозу получают, как в примере 2 а. б)Нанесение фермента на светочувствительный материал. 10 мг пероксидазы из хрена (Re nal, ВНР) с активностью 400 ед./м растворяют в 100 мл 0,,1 М ацетата натрия, рН 5,0, и фильтруют через карбоксиметилцеллюлозу. Светочувст вительный носитель погружают на 1-3 с в раствор фермента и промаха ют фильтровальной бумагой. в)Получение скрытого изображения. Фотоматериал экспонируют, как в примере 1 в. г)Закрепление изображения. Экспонированный образец отмываю от несвязанного фермента при 20- 37с дважды по 15 мин раствором 1 примера 1,затем 15 мин О,1 М KNOj О,1 М раствором ацетата натрия, рН 5,0. д)Проявление. Закрепленное скрытое изображени из фотоиммобилизованной пероксидазы проявляют при комнатной темпера туре 0,5-1 ч в растворе, содержаще мл: 0,01 М о-дианизидин в этаноле10,1 М ацетат натрия, 1 мМ CaCl2 , рН 5,0 10 3%-ная перекись , водорода 0,5 Получают темн.о-коричневое изо- бражение на белом фоне, которое Зг 4 раза по 2-3 мин промывают водой и сушат. Пример 4. а) Получение полимерного светочувствительного материала. Задубленный желатиновый слой фо- топластинки с отмытым гапогенидом серебра смачивают раствором N-ме- тил-И-(2-хлорэтил)-п-азидобензиламин гидрохлорида в абсолютном метаноле ,(50 мг/мл из расчета 0,1 мл/см и термостатируют 12 ч при комнатной температуре. Алкилированный желатиновый слой последовательно промывают в течение 1 ч 1 М NaCl, 3-4 раза по 2-3 мин водой и сушат на воздухе. Нанесение фермента, получение скрытого изображения, закрепление его и проявление проводят, как в примере 2 б, в, г, д. Пример 5. а) Получение полимерного светочувствительного материала. Лист хроматографической бумаги ФН-П (8x40 см) помещают в колбу на 500 мл и приливают раствор п-нит- робензоилхлорида (П г) в 450 мл пирнцина. Реакционную смесь нагревают до 80с и выдерживают при этой температуре 6 ч. После этого пиридиновый раствор сливают, а бензоилиро- ванную целлюлозу трижды промывают разбавленным раствором , 3-4 раза по 2-3 мин водой, вымачивают 1 ч в 0,01 М , опять промывают водой, затем ацетоном и сушат на воздухе. Восстанавливают п-нитробензой- ный эфир целлюлозы 15 .мин при в растворе, содержащем 500 мл 5%- ного раствора сегнетовой соли в воде: 10 мл 15%-ного раствора ИСЦп-Аминобёнзойный эфир целлюлозы 3- 4 раза по 2-3 мин промывают водой, этанолом и сушат на воздухе. Диазо- тирование материала проводят при 0, в течение 0,5 ч в растворе 3 г NaNOj в 100 мл, 0,01 М HCI. Эту и последующие операции проводят в затененном месте. После этого бумагу промывают ледяной водой и помещают в раствор 2,5 г NaN,, в 0,01 М HCI на 0,5 ч при 0-5С. Светочувствительный п-азидобензойный эфир целлюлозы 3-4 раза по 2-3 мин промывают цодой, затем ацетоном и сушат. Нанесение фермента, получение скрытого негативного изображения. 3 Лист фосфоцеллюлозы (Watraan Р 8 в )opMe промывают трижды в 1 М растворе NaCl по 15 мин, затем 34 раза водой по 2-3 мин и сушат на воздухе. Полученную натриевую соль фосфоцеллюлозы помещают в плоско донную прямоугольную кювету, нанося раствор N-метил-Н-(2-хлорэтил)-п-аз добензиламин гвдрохлорида в абсолют ном метаноле (30 мг/мл) из расчета 0,1 мл/см. Эту и последующие опера ции проводят в затененном месте или при красном свете. Кювету термоста- тируют в течение 3 ч.при ЗОС. Модифицированную фосфоцеллюлозу после довательно отмывают в 1 М NaCl 1 ч 3-4 раза водой по 2-3 мин, 1 ч этанолом, ацетоном и.сушат. б)Нанесение фермента на светочувствительную подложку. Суспензию лактатдегидрогеназы из мьш1ц свиньи (Reanal, ВНР), кон центрация 10 мг/мл, активность 2 ед /мг, в 3 М (Ш14)2304, разбавляют в 10 раз 1 М раствором трис: НС1, рН 8,0. Полученный раствор фильтруют через фосфоцеллюлозу. Светочувствительный материал погружают на 1-3 с в фильтрованный раствор фермента и промакают фильтровальной бумагой, в)Получение скрытого негативного изображения. Полученный фотоматериал экспонируют через негатив прлным спектром ДРШ-500 0,2-4 мин с расстояния 15 с или тремя лампами БУФ-15 в течение 10-20 с через трафарет с расстояния 40 см. г)Закрепление проводится при 20-37С дважды по 15 мин раствором 0,1 М трис: НС1, 1 М NaCl, 1 мМ MgCl, 10 ZnCl, 5 г/л Тритон-Х 100, рН 8,5 (раствор 1), затем 15 мин раствором 1 М фосфата натрия рН 7,5. д)Проявление. Отмытое от несвязанного фермента скрытое изображение проявляют при в течение 0,5-1 ч в растворе, содержащем: Никотинаденин- динуклеотид, мг20 Феназинметасульфат, мг2 1 М лактат натрия, мл4 4. 4 Нитротетразо- лиевый синий, 0,1 М фосфат натрия, рН 7,4, После проявления получают фиоле- товое изображение на белом фоне, ко торое 3-4 раза по 2-3 мин промьюают водой и сушат. Пример2. а) Получение светочувств5 тельногп полимерного материала. , Лист карбоксиметнпцеллюлозы (Watman СМ 82) в СК -форме на 15 мин погружают в 0,01 М раствор NaOH, вы-держивают I ч в I М NaC1 и сушат при комнатной температуре. Полученную натриевую соль карбоксиметилделлкшо- зы в кювете смачивают раствором ал- килирующего фотореагента К-иетил-N- -(2-хлорэтил)-п-азидобензиламин гид- рохлорида в абсолютном метаноле (30 мг/мл) из расчета 0,1 мл/см. Эту и последующие, операции проводят в затененном месте. Кювету термостати- руют 3 ч при 50 С. Далее промывают 1 ч в 1 М NaCl, 3-4 раза по 2-3 мин в воде, I ч в этаноле, ацетоне и сушат . б)Нанесение фермента на светочувствительный материал. 50 мг щелочной фрсфотазы из кишок цыплят (Reanal, ВНР) с активностью 0,4 ед/мг растворяют в 100 мл раствора I мМ трис: НС1, 1 М NaCl, рН 8,2, добавляют 10 г (. и фильтруют через карбоксиметилцел- лкшозу. Модифицированную подложку на 1-3 с погружают в раствор фермента и промакают фильтровальной бумагой, в)Получение скрытого изображеиия. Приготовленный фотоматериал экспонируют через негатив лампой ДРШ-500 в течение 1-4 мин с расстояния 15 см или тремя лампами БУФ-15 в течение 15-20 с через трафарет с расстояния 40 см. г)Закрепление изображения проодят при 20-37°С дважды по 15 мин аствором 1 примера 1,затем 15 мин аствором 1 мМ трис: НС1, 1 М NaCl, 1 MMMgCl2, lO ZnClj, рН 9,2. д)Проявление. Закрепленное скрытое изображение з фотоиммобилизованной щелочной осфотазы проявляют методом одноременного азосочетания продуктов

1. Способ получения ферментног го фотографического материала, включающий обработку полимерной подлоз Г ки раствором фермента, о т л и - чающийся тем, что, с целью удешевления фотоматериала, повышения его светочувствительности и качества изображения, подложку предварительно обрабатывают раствором азида, а фермент используют в активной форме, не содержащей высокомолекулярных агрегатов.. 2. Способ получения изображения на ферментном фотографическом мате-. риале, включающий его экспонирование ультрафиолетовым светом, прояв- . ление и закрепление в водных ворах, отличающийся тем, что, с целью повьшения качества изображения, закрепляют перед проявлением в растворе, содержащем дополгнительно детергент, а проявляют в растворе, содержащем дополнительно реагенты гистохимической визуализации фермента. СО 00 i4i