Способ получения эндонуклеазы рестрикции Советский патент 1985 года по МПК C12N9/14 C12N15/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно, к производству ферментов. Эн|1онуклеаза рестрикции Mva I может быть Использована для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженериио Известен способ получения эндонуклеазы рестрикции Есо R II, узнаю щей и расщепляющей последовательность нуклео1 идов 5CC(A/T)GG, предусматривающий культивирование штам ма Escherichia coli В 834/ps в среде следукицего состава, г/л: дрожжевой экст |ракт - 5,0i пептон - 10,0} NaCl 6,5, Ш4С1 - 1,0, НЗгНРО - 7,0| KHjPO - 3,0, разрушение клеток в прессе ДКМ-3, фракционирование полиэтиленимином, осаждение белков сернокислым аммонием, дигшиз, хроматог- рафию на ДЭАЭ целлюлозе в 10 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,0, содержащем 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 5% глицерин, хроматографию на фосфоцеллюлозе, осеждение сернокислым аммонием, гель-хроматографию на сефадексе G-100, рехроматографию на фосфоцеллюлозе и диализ DJ- Эндонук леаза рестрикции Есо R II узнает и расщепляет последовательность нуклео тидов З CC(A/T)GG, однако она не спо .собна расцеплять последовательность 5CC(A/T)GG (где С - метилцитозин) что является серьезным недостатком, так как рекомбинантные молекулы ДНК вьщеленные из штаммов E.coli, содержащих метилазу dem, расщепляются не полностью рестриктазой Есо R II изза частичного метилирования цитозина в узнаваемой последовательности. Другими недостатками известного способа является сложная и трудоемкая схема очистки и сравнительно низкий выход фермента (6,600 ед/г биомассы), Способ получения эвдонуклеазы рестрикции Tag XI, узнанлцей пентанук леотид 5 CC(A/T)GG, предусматривает культивирование штамма Thertmas aguaticus на питательной среде, содержащей 100 МП 1% ТУЕ (10 г триптона и 10 г дрожжевого экстракта в 1 л воды)/, 1 МП/л раствора микроэлементов Нитче (Nitsche) (0,5 мл H2S04, 2,2 Т MnSO, 0,5 г ZnSO, 0,5 г НзР0 0,016 г CuSO, 0,025 г НаМоОг, 0,046 г CaCl2-6H20 в 1 л воды) и по 50 мл/л растворов А и Б Кастенгольца соответственно А:2,О г нитроуксусной кислоты, 20,0 мл 0,03% FeCl,, 1,2 г CaSO -2HjO, 2,1 г KNOj в 1 л воды и Б: 2,0 г ,,0, 0,16 гNaCl 14,0 г НаЫОз, 2,2 г в 1 л воды) в 1 л воды, разрушение клеток ультразвуком, осаждение нуклеиновых кислот стрептомицинсульфатом, фракционирование белков сернокислым аммонием, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе а 20 мМ трис-НС1-буфере рН . 7,5, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 7 Mti 2-меркаптоэтанол, элюцию фермента с . колонки ДЭАЭ-целлюлозы градиентом NaCl 0-0,4 М, диализ, хроматографию на гепарин-сефарозе в 20 мМ трис-НС1буфере рН 7,5, содержащем 0,5 мМ ДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, элюцию фермента с колонки с гепарин-сефарозой градиентом NaCl 0-0,75 М, диализ. Получили 5 000-6 000 ед/г биомассы. Эндонуклеаза рестрикции Tag XI расщепляет пентануклеотид (A/T)GG вне зависимости от наличия или отсутствия метилированного цитозина (помеченного звездочкой) t2. Однако способ получения эндонуклеазы Tag XI имеет ряд недостатков: сравнительно невысокий выход фермента (5 000-6 000 ед/г биомассь сложную и трудоемкую схему очистки рестриктазы и многокомпонентную питательную среду культивирования штамма Thermus aguaticus. Цель изобретения - повьш1ение вы-i. хода эндонуклеазы рестрикции, Цель достигается способом получения эвдонуклеазы рестрикции, включающим выращивание микроорганизма продуцента фермента, обладаклцего способностью узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 СС (A/T)GG, разрушение клеток ультразвуком, фракционирование белков и очистку фермента путем хроматографии, отличающимся тем, что в качестве микроорганизма - продуцента фермента использУют штамм Micrococcus varians ЩШМ В-2661, а очистку фермента проводят на фосфоцеллюлозе F11 в 10 ьФ1 калий-фосфатном буфере рН 6,5-7,1 и-элюцией градиентом хлористого калия 0,3-1,2 М. Цель достигается способом, отличающимся тем, что штамм Micrococcus varians ЦМПМ В-2661 выращивают на питательной среде, содержащей (г/л): пептон 9,0-10,00. дрожжевой экстракт - 4,5-5,5, хлористый натрий 4,5-5,0. Пример. Используемьй штамм Micrococcus varians RFL 19 вьщелен из пищевода рогатого скота в Институте эпидемиологии, гигиены и микро биологии Литовской ССР. Штамм идентифицирован во ВНВДГПЭ и хранится в музее ВНИНгенетики под номером ЦМПМ В-2661. Полученный штамм Micrococcus varians RFL 19 обладает следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками. Сферические клетки величиной 1,0-1,5 мкм в диаметре. В стандартньк жидких средах клетки расположены в виде неправильных , в парах или по одной. На МПа после 24 ч инкубации в термостатепри 37 С образует круг лые с ровными краями колоний 1, 5i мм в диаметре Колонии гладкие, с агяром не срастаются, желтоватого цвета. В мясо-пептонном бульоне обр зует мутность. Оптимальная температура роста 37°С. При 45°С обычно не растет. Грамположительные, каталаз оположительные. Строгий аэроб. Желатину гидролизирует. Глюкозу и ксилозу окисляет. Нитраты восстанав ливают в нитриты. Резистентный к но вобиоцИну ,0 мг/мл. Клетки не подвергаются лизису с лизоцимом при .концентрации его 100 мг/кп. Культур хранится в пробирках на среде МПА п вазелиновым маслом при +4°С. Полученная эндонуклеаза Mva I ха рактеризуется следунхдими свойствами узнает и специфически расщепляет последовательность 5CC(A/T)GG в мо лекуле ДНК; оптимал ное значение рН -для дейс вия фермента 8,0-9,0; оптимальная температура действия 30-40°Cj для активации эндонуклеазы требу ются ионы Mg, их оптимальная концентрация 10-15 мМ. Получение эндонуклеазы Mva I из Micrococcus varians RFL 19 Последовательность операций. Получение биомассы поддерживание посевного материала;выращивание посевного материала; культивирование штамма. 454 Вьщеление и очистка рестриктазы разрушение клеток; хроматография на фосфо-i целлюлозе. Для получения биомассы используют следующую аппаратуру: круговые термостатированные качалки, фотоэлектрокалориметр ФЭК-56М, лабораторный ферментер типа Биолафит и проточную центрифугу С-44, Для поддерживания и культивирования щтамма используют две среды: мясо-пептонный бульон (МПБ и МПА) и питательную среду, содержащую, г/л: пептон - 10,0; дрожжевой экстракт 5,0 и NaCl - 5,0, рН 7,0. Мясо-пептонный агар для поддержания и оживления штамма готовят по известным методам (Практикум по микробиологии, 1976) из мясо-пептонного бульона с последующим добавлением агара до 2%-ной концентрации рН 7,3-7,4, МПБ и. МПА стерилизуют при 0,8 атм 30 мин. МПБ оазливают в пробирки по 5 мп, а МПА - в чашки Петри. Питательную среду для культивирования стерилизуют при 1 атм 20 мин. Штамм Micrococcus varians RFL 19 поддерживают впробирках на среде МПА под вазелиновым маслом при +4С. Для оживления Microcossus varians пересевают на МПА и инкубируют колонии при 37°С в течение 18-20 ч. Затем бактериологической петлей пересевают в пробирку с 5 МП МПБ и инкубируют в термостатированной качалке с 250 об/мин при в течении 67 Ч-. Для засева ферментер на 10 л культуральной среды готовят 0,5 л инокулята (2 качалочные колбы по 250 мл). В каждую колбу засевают по 0,1 .мл 6-7 ч суспензии клеток. Выращивание инокулята проводят на круговой термостатированной качалке (250 об/мин) при 37С 18 20 ч. Оптическая плотность инокулята после вырапщвания составляет р,/ 2,6-2,8 о.в. Полученный инокулят (0,5 л) засевают в ферментер с 9,5 л культуральной среды при рН среды 7,0 и . Выращивание проводят с постоянной подачей воздуха в первые 2 ч вьфащивания 4 л/мин, последующие - 9-12 л/мин и постоянным перемешиванием в первые 2 ч 300-400 об/мин, последующие 500 об/мин. Спустя 7-8 ч выращивание прекращают. Оптическая плотность культу

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, включающий вьтращивание микроорганизма - продуцента фермента, обладаклцего-способностью узнавать и расщеплять последователь®№СОШЗ|: ДЯ / ff ;..,..f iiv:::::± nl чЧ .1 - -..lJ4, ность нуклеотидов 5СС (A/T)GG, разрушение клеток ультразвуком, фракционирование белков и очистку фермента путем хроматографии, о т л и ч. аю щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода фермента, в качестве микроорганизма-продуцента фермента используют штамм Micrococcus varians ЦМПВ В-2661, а очистку фермента проводят на фосфоцеллюлозе Р 11 в 10 мМ калий-фосфатном буфере рН 6,57,1 и элюцией градиентом хлористого калия 0,3-1,2 И. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что штамм Microi coccus varians ЦМПМ В-2661 вьфащиko вают на питательной среде, содержащей, г/л: Пептон9,0-10,0 Дрожжевой экстракт4,5-5,5 Хпористый натрий4,5-5,0