ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИЙ УФ-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ ФОТОМАТЕРИАЛ Российский патент 2003 года по МПК G03C1/79 

Изобретение относится к области создания светочувствительных материалов на основе составов, содержащих ферменты, и может быть использовано для полутоновой регистрации УФ-излучения. В настоящее время не существует ферментсодержащих слоев, гарантирующих длительный срок хранения регистрирующей среды.

Активирующее воздействие УФ-света на слои, содержащие модифицированные ферменты, описано в литературе. В основе таких материалов лежит использование неактивных светочувствительных производных ферментов. Так, например, исходно неактивный димер папаина под действием УФ-света распадается на две активные молекулы фермента. Иной принцип был описан для химотрипсина. Модификация активного центра производными цис-коричной кислоты приводит к получению относительно стабильных неактивных производных фермента. УФ-облучение таких производных вызывает цис-транс-изомеризацию остатка коричной кислоты и образование нестабильных транс-производных, способных к быстрой регенерации активного фермента.

В работе (Никольская И. И., Создание светочувствительного материала с использованием ферментов, дисс. канд. хим. наук, М., МГУ, 1979, 147 с.) описаны слои, состоящие из желатины и неактивного светочувствительного производного фермента. В качестве светочувствительных производных фермента использовали синтетический димер папаина и цис-циннамоил-химотрипсин. Светочувствительный состав наносили на подложку и высушивали. При освещении такого слоя УФ-светом через шаблон на экспонированных участках исходно неактивный фермент переходит в активное состояние и гидролизует желатину при помещении отпечатка в буферный раствор. На неэкспонированных участках фермент остается неактивным и не способен гидролизовать желатину при проявлении. Таким образом получают рельефное позитивное изображение.

В этом случае носитель светочувствительной компоненты (желатиновая матрица) является одновременно "проявителем" скрытого изображения, и конечное проявленное изображение получают по принципу "да-нет". Полутоновое изображение может быть получено при использовании матриц, инертных по отношению к ферменту. В этом случает при проявлении используются субстраты, дающие в результате ферментативной реакции нерастворимые окрашенные продукты. При этом оптическая плотность конкретного участка слоя после его проявления прямо пропорциональна количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Эта величина, в свою очередь, прямо пропорциональна количеству активного фермента на данном участке, т.е., в конечном итоге, дозе, полученной данным участком слоя при экспонировании.

Простейшим вариантом реализации такого подхода явился материал на базе бумаги, высушенной после пропитки раствором цис-циннамоил-химотрипсина (Березин И.В., Варфолдомеев С.Д., Казанская Н.Ф., Мартинек К., Хлудова М.С. Способ получения фотографического изображения. Авт. свид. СССР 439780, 1971). Данный способ, однако, ограничен подложкой - бумагой.

Наиболее близким к заявленному ферментсоджержащему УФ-чувствительному фотоматериалу является материал, описанный в патенте (Audran R.G.L., Hilaire J. -C., Bourdon J.A.L., Lestienne A.F.P., Photographic Process and Elements, Pat. USA 3515551, 1970), в котором авторы предлагают добавлять к активному ферменту красители, которые катализируют окисление фермента под действием УФ-света, переводя его в неактивную форму. В этом случае светочувствительный слой состоит из желатины, активного фермента и сенсибилизатора фотоактивации. В качестве фермента предлагались трипсин, химотрипсин, папаин, ренин, бромелаин и другие бактериальные и грибные протеиназы. В качестве сенсибилизаторов окисления белка фотоматериал содержал флюоресцин и его производные, рибофлавин, производные акридина. Светочувствительный слой наносили на подложку и высушивали. При освещении такого слоя УФ-светом через шаблон на экспонированных участках фермент окисляется, т.е. переходит в неактивное состояние, и не способен гидролизовать желатину при помещении отпечатка в буферный раствор. На неэкспонированных участках фермент остается активным и при проявлении гидролизует желатину. В результате получают рельефное негативное изображение.

Общим недостатком всех вышеперечисленных способов является низкая стабильность фермента как светочувствительной компоненты, что резко ограничивает срок хранения данных фотоматериалов.

Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является повышение стабильности ферментсодержащего светочувствительного слоя и увеличение срока хранения УФ-светочувствительного материала на его основе. Это достигается при помощи ковалентной иммобилизации светочувствительного производного протеолитического фермента в полиакриламидную гелевую матрицу. Более конкретно, поставленная задача достигается тем, что ферментсодержащий УФ-чувствительный фотоматериал состоит из подложки и нанесенного на нее светочувствительного слоя, включающего в себя фермент и аминсодержащее соединение. Светочувствительный слой ферментсодержащего фотоматериала содержит, мас.%: акрилоированное светочувствительное производное протеолитического фермента - 0,5-1,0; акриламид - 15,0-30,0; N,N'-метилен-бис-акриламид - 0,01-0,05; персульфат аммония - 0,001-0,005; N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин - 0,007-0,015; вода - остальное.

Толщина светочувствительного слоя обычно составляет 80-150 мкм. В качестве подложки заявляемый светочувствительный фотоматериал содержит стекло, или лавсан, или триацетатную пленку. Эти подложки целесообразно покрывать капроновой сеткой для повышения механической прочности светочувствительного слоя. В качестве подложки материал может также содержать бумагу. В этом случае покрытие подложки капроновой сеткой не требуется.

При толщине менее 80 мкм полученный светочувствительный слой не обладает необходимой механической прочностью. При толщине более 150 мкм ухудшается его адгезия к подложке, появляются неровности, что ухудшает качество получаемого изображения.

При уменьшении количества акрилоированного светочувствительного производного протеолитического фермента ниже 0,5 мас.%, акриламида - ниже 15,0 мас. %, N,N'-метилен-бис-акриламида - ниже 0,01 мас.%, персульфата аммония - ниже 0,001 мас.%, N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина - ниже 0,007 мас.% получается очень рыхлая структура пленки с низкой механической прочностью. Соответственно, увеличение количества указанных компонентов светочувствительного слоя выше заявленных приводит к получению жестких слоев, где практически невозможно вести ферментативное проявление скрытого изображения из-за возникающих стерических и диффузионных затруднений.

На чертеже схематично изображена ковалентная иммобилизация белков в полиакрилатные гели. Поверхность белковой глобулы модифицирована остатками, содержащими двойные связи (например, взаимодействием хлорангидрида акриловой кислоты с аминогруппами белка), которые способны к сополимеризации в смеси, содержащей акрилатный мономер и бифункциональный сшивающий агент (например, N, N'-метилен-бис-бис-акриламид). В результате получена сетчатая структура полимерного геля, в которую белок ковалентно включен через предварительно введенные на его поверхность акриловые остатки. На примере фермента химотрипсина ранее было показано, что такие препараты демонстрируют уникальную стабильность иммобилизованного несветочувствительного фермента во времени (Лукашева Е.В., Айсина Р.Б., Казанская Н.Ф., Еремеев Н.Л. Свойства α-химотрипсина, ковалентно включенного в сферические микрогранулы из полиакриламида. Биохимия, 1980, т. 45, 3, с.449-454). Ковалентная иммобилизация светочувствительного производного фермента в полиакриламидную гелевую матрицу не влияет на его светочувствительные свойства, однако не было сведений о том, что такие структуры могут быть использован в качестве светочувствительного материала. (Айсина Р.Б., Еремеев Н.Л., Казанская Н.Ф., Лукашева Е. В. Микрогранулированная форма цис-циннамоилхимотрипсина для полутоновой ферментной фотографии. Биохимия, 1981, т.4б, вып.6, с.979-985).

Могут быть использованы все светочувствительные модифицирующие группы (нис-циннамоил, цис-нитроциннамоил, п-диметиламино-цис-циннамоил, n-(N,N, N-триметиламино)-цис-циннамоил в любых комбинациях с такими ферментами, как химотрипсин, трипсин, папаин, термитаза, субтилизин.

Заявляемый УФ-светочувствительный фотоматериал может быть получен следующим образом.

Пример 1
К 1 мл водного раствора, содержащего 1,0 мас.% акрилоил-цис-циннамоил-химотрипсина, 15,0 мас. % акриламида и 0,05 мас.% N,N'-мeтилeн-биc-aкpилaмидa, добавляют инициаторы полимеризации - 0,002 мас.% водного 0,78 М раствора персульфата аммония и 0,01 мас.% N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина. Тщательно перемешивают. Полученный раствор наносят на стекло, покрытое капроновой сеткой, накрывают прижимным стеклом и инкубируют в атмосфере инертного газа в течение 40 мин при комнатной температуре до окончания процесса полимеризации. Материал высушивают на воздухе в течение 2-3 ч и хранят в темноте при температуре 4^oС. Расход раствора - 1 мл/100 см². Толщина высушенного светочувствительного слоя 80 мкм.

Полученный светочувствительный материал экспонируют через негатив УФ-светом с длиной волны облучения 254 нм. Экспонированный материал для проявления погружают на 5 мин в раствор 10^-3 М 5-броминдоксилацетата (рН 7,8) при комнатной температуре. Изображение полутоновое позитивное, разрешающая способность - не менее 200 линий/мм. Срок хранения полученного материала с момента изготовления - не менее 2-х лет.

Пример 2
Светочувствительный фотоматериал получен по примеру 1, но светочувствительный состав содержит, мас.%: акрилоил-п-диметиламино-цис-циннамоил-субтилизин - 0,5; акриламид - 30,0; N,N'-метилен-бис-акриламид - 0,01; персульфат аммония - 0,005; N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин - 0,007; вода - остальное и в качестве подложки он содержит бумагу.

Толщина высушенного светочувствительного слоя - 150 мкм, длина волны облучения светочувствительного материала 320 нм. Экспонированный материал для проявления погружают на 5 мин в раствор 10^-3 М индоксилового эфира N-ацетил-L-лейцина (рН 8,0) при комнатной температуре. Изображение полутоновое позитивное, разрешающая способность - не менее 200 линий/мм, срок хранения полученного материала с момента изготовления - не менее 2-х лет.

Пример 3
Светочувствительный фотоматериал получен по примеру 1, но светочувствительный состав содержит, мас.%: акрилоил-цис-п-нитроциннамоил-трипсин - 0,7; акриламид - 20,0; N,N'-метилен-бис-акриламид - 0,03; персульфат аммония - 0,001; N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин - 0,015; вода - остальное и в качестве подложки он содержит лавсан, покрытый капроновой сеткой.

Толщина высушенного светочувствительного слоя - 120 мкм, длина волны облучения светочувствительного материала 290 нм, проявление осуществляют, как в примере 1, разрешающая способность - не менее 200 линий/мм. Срок хранения материала с момента изготовления - не менее 2-х лет.

Пример 4
Светочувствительный фотоматериал получен по примеру 1, но светочувствительный состав содержит, мас.%: акрилоил-п-(N,N,N-триметиламино)-цис-циннамоил-термитазу - 0,8; акриламид - 25,0; N,N'-метилен-бис-акриламид - 0,04; персульфат аммония - 0,003; N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин - 0,012; вода - остальное и в качестве подложки он содержит триацетатную пленку, покрытую капроновой сеткой.

Толщина высушенного светочувствительного слоя - 100 мкм, длина волны облучения светочувствительного материала 275 нм, проявление осуществляют, как в примере 2, разрешающая способность - не менее 200 линий/мм. Срок хранения материала с момента изготовления - не менее 2-х лет.

Представленные примеры показывают, что изобретение позволяет получить ферментсодержащий УФ-чувствительный фотоматериал с длительным сроком хранения и обеспечивает высокое качество получаемого изображения.

Изобретение относится к УФ-чувствительному ферментсодержащему фотоматериалу для использования в полутоновой регистрации УФ-излучения. Описывается фотоматериал, состоящий из подложки и нанесенного на нее светочувствительного слоя, содержащий акрилоированное светочувствительное производное протеолитического фермента, акриламид, N,N'-метилен-бис-акриламид, персульфат аммония, N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамин и воду. Толщина светочувствительного слоя - 80-150 мкм. В качестве подложки использует стекло, или лавсан, или триацетатную пленку, или бумагу. Подложка может быть покрыта капроновой сеткой. Получают высококачественное полутоновое позитивное или негативное изображение. Срок хранения светочувствительного материала - не менее 2 лет. 4 з.п.ф-лы, 1 ил.

1. Ферментсодержащий УФ-чувствительный фотоматериал, состоящий из подложки и нанесенного на нее светочувствительного слоя, включающего фермент и аминсодержащее соединение, отличающийся тем, что в качестве светочувствительного слоя он включает полимеризованный и высушенный раствор, содержащий, мас.%:
Акрилоированное светочувствительное производное протеолитического фермента - 0,5 - 1,0
Акриламид - 15,0 - 30,0
N,N'-метилен-бис-акриламид - 0,01 - 0,05
Персульфат аммония - 0,001 - 0,005
N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин - 0,007 - 0,015
Вода - Остальное
2. Ферментсодержащий УФ-чувствительный фотоматериал по п.1, отличающийся тем, что толщина светочувствительного слоя составляет 80 - 150 мкм. 3. Ферментсодержащий УФ-чувствительный фотоматериал по п.1, отличающийся тем, что в качестве подложки он содержит бумагу. 4. Ферментсодержащий УФ-чувствительный фотоматериал по п.1, отличающийся тем, что в качестве подложки он содержит стекло, или лавсан, или триацетатную пленку. 5. Ферментсодержащий УФ-чувствительный фотоматериал по п.4, отличающийся тем, что подложка покрыта капроновой сеткой.