Способ получения лимонной кислоты глубинным методом Советский патент 1986 года по МПК C12P7/48 C12R1/685 

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к технологи получения пищевых органических кислот, в частности лимонной,кислоты, способом глубинной ферментации углеводе одержащего сырья, например мелассы, погруженной культурой микроорганизма - продуцента лимонной кислоты.

Цель изобретения - повьшение вы- хода лимонной кислоты и создание .оптимальных условий для ферментации при использовании меласс с содержанием кальция свьше 0,8%.

Способ осуществляют следующим образом.

Посевной мицелий в течение 24- 36 ч выращивают на среде из мелассы, содержащей 4,5-6% сахара, в одну стадию: для ферментации подготавливают ме лас сную среду с начальной концентрацией сахара 13-14%, В качестве ингибитора образования побочных кислот применяют сернокислый цинк в дозе, соответствующей 10-17 мг на литр среды. Объем заполнения ферментатора 70-75%. Увеличение концентрации свьше 6% приводит к непроизводительному расходу сахара, дополнительным затратам сырья. Уменьшение концентрации ниже 4,5% настолько увеличивает период адаптации гриба- продуцента в результате резкого перепада концентрации питательных веществ при переводе подрощенного мицеЛия в ферментированные растворы, что процесс становится нерентабельным

Использование мелассной среды с высокой концентрацией сахара и одновременное заполнение объема ферментатора на 70-75% позволяет использовать в одном цикле (без дополнительных подливов) до 7,5 т мелассы и, следовательно, получить высокий валовый выход лимонной кислоты с ферментатора. При использова- ., кальция возрастает содержание азота.

НИИ концентрированных мелассных сред, когда весь запас питательных веществ дается сразу, процесс адаптации и роста гриба происходит с первых суток, а затем идет активный биосинтез лимонной кислоты, увеличение титруемой кислотности без снижения до конца процесса.

Для обеспечения нормальной аэрации в ферментаторе эрлифтного типа и более полной утилизации субстрата, в процессе ферментации на 2-е и 3-й сутки производят долив стерильной

50

что способствует накоплению побочных кислот, в частности щавелевой.

Дозировка ZnSO. зависит от исполь зуемых образцов мелассы, от доз фер- роцианида кальция и щавелевокислого аммония, применяемых для обработки

мелассы. Вещества, используемые для осаждения тяжелых металлов и солей кальция, не имеют избирательного 55 действия и в процессе соосаждения вьюодят из раствора ряд необходимых микроэлементов, в том числе и Zn. Экспериментально / установлено, что

0

2212412

вода в количестве 4-5% от объема ферментатора. Продолжительность ферментации 4,5-5,5 сут.

Необходимость доливов стерильной 5 воды вызвана тем, что в результате испарения среды увеличивается вязкость растворов, возрастает концент-, рация продуктов метаболизма гриба, ухудшаются условия питания и газо- 0 обмена. Доливы воды в количе(;тве 4-5% от объема среды снимают зти негативные явления и улучшают условия кислотообразования. Выбранное время долива (2-е и 3-й сутки 5 ферментации) наиболее благоприятно, так как именно в этот период в результате нарастания мицелиальной массы и высокой степени аэрации происходит значительное испарение среды и накопление продуктов жизнедеятельности гриба. При более позднем сроке начала доливов происходит снижение технологических показателей процесса. Прозводить долив воды на первые сутки, нецелесообразно, так как гриб только начинает накапливать биомассу и любые операции, связанные с доливом, увеличивают вероятность инфицирования среды.

В качестве гриба-продуцента используют осмофильный штамм AspergiL- lus niger Л-4 (штамм депонирован в Центральном музее промьшшенных микроорганизмов института ВНИИгенетика под номером Г-171).

Высокая исходная степень заполнения ферментаторов достигается в результате частичного (1/2) осаждения солей кальция щавелевокислым аммонием. Вследствие этого происходит сравнительно небольшое вспенивание среды, что позволяет сохранить необходимый уровень заполнения ферментатора на 70-75%. При полном осаждении солей

S

30

5

40

50

что способствует накоплению побочных кислот, в частности щавелевой.

Дозировка ZnSO. зависит от используемых образцов мелассы, от доз фер- роцианида кальция и щавелевокислого аммония, применяемых для обработки

мелассы. Вещества, используемые для осаждения тяжелых металлов и солей кальция, не имеют избирательного 55 действия и в процессе соосаждения вьюодят из раствора ряд необходимых микроэлементов, в том числе и Zn. Экспериментально / установлено, что

3

ZnSO, применяемый в дозе 10-17 мг на литр мелассной среды, дает возможность направить биосинтез в сторону максимального продуцирования лимонной кислоты за счет угнетания биосинтеза глюконовой кислоты при ферментации мелассных сред.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выращивание кислотообразующего мицелия и синтез лимонной кислоты осуществляли в лабораторных условиях на качалке типа АВУ-50р с числом качаний 160 в минуту в колбах емкостью 700 см при 32 С. В качестве продуцента использовали Aspergillus niger штамм Л-4.

Для подращивания мицелия приготавливали мелассную среду, содержащую 5% сахара по следующему рецепту, г/л:

Меласса106,4

Щавелевокислый

аммоний2,11

Ферроцианид калия 0,35

Однозамещенный

фосфат калия0,16

Углекислый натрий

безводный0,146

Сульфат цинка водный 0,005

Сульфат магния водньй 0,25

Готовую стерильную среду разливал в качалочные колбы по 50 мл и засевали суспензией конидий. Для приготовления суспензии 15 мг конидий замачивали в 10 мл мелассной среды, приготовленной для подращивания, и интенсивно стряхивали в течение 5 мин. Подращивание мицелия проводил 24 ч.

Для ферментации приготавливали мелассную среду, содержащую 13% сахара следующего состава, г/л:

Меласса276,0

Ферроцианид калия 0,9

Углекислый натрий

безводный0,38

Однозамещенный фосфат

калия0,16

Сульфат цинка водный 0,005

А

Пример 2. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли как в примере 1. Процесс ферментации отличается от примера 1 тем, что приготавливаемый мелассный раствор обрабатывали щавелевокислым аммонием в количестве, необходимом для осаждения половины солей кальция (из

2124 14

расчета содержания Са в мелассе в пересчете на СаО). Одновременно увеличивали в 2,0 раза количество вносимого сернокислого цинка по отноше- с нию к оптимальной дозе, установленной для разбавления сред, используемых в известном способе.

Рецепт мелассной среды для ферментации, г/л:

0 Меласса276,0

Ферроцианид калия 0,9 Углекислый натрий безводный0,38 .

Щавелевокисльм

5 аммоний2,73

Однозамещенньш

фосфат калия0,16

Сульфат цинка

водный -0,010

0 Результаты испытаний даны в табл. 1

Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кис- 5 лоты, полученное с колбы, возрастает на 18,7%, а выход от сахара на 5,7% по сравнению с прототипом.

Пример 3. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли Q так же, как в примере 2. Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что приготовленньш мелассный раствор обрабатывали щавелевокислым .аммонием в количестве, необходимом для полного осаждения солей кальция 5 (из расчета содержания Са в мелассе в пересчете на СаО). Одновременно увеличивали в 2,0 раза количество вносимого сернокислого цинка по отношению к оптимальной дозе, уста- 0 новленной для разбавления сред, используемых в известном способе.

Рецепт мелассной среды для ферментации, г/л:« Меласса 276,0 5 Ферроцианид калия 0,9 Углекисльй натрий безводный 0,38 Щавелевокислый натрий, безводньш 5,46 0 Однозамещенный фосфат

калия0,16

Сульфат цинка водный 0,01 Сравнивая данные, полученные при ведении процесса по предлагаемой 5 технологии, количество лимонной кислоты, полученное с,колбы, снижается на 10,8%, выход от сахара на 12,4%. В растворе накапливается 25,8% щаве-г

левой кислоты, тогда как по прототипу ее содержание составляет 11,9, а про предлагаемой технологии щавелевая кислота не синтезируется вообще (табл. 1).

Готовую среду разливали в качалоч ные колбы по 50 мл и засевали 10 мл подрощенного мицелия. Процесс ферментации длился 5 сут. С колбы получено 5180 мг общей кислоты, в составе синтезируемых кислот лимонная кислота составила 96,3%, глюконовая 3,7%, щавелевая кислота отсутствовала, выход лимонной кислоты от сахара 71,25%.

Контролем служил процесс, осуществляемый по технологии прототипа, при котором мицелий производственного штамма Aspergillus niger Л-4 подращивают на мелассной среде, содержащей 3% сахара в течение 2А ч. Подросшим мицелием в количестве 10 мл засевали ферментационную ме- лассную среду, содержащзто 3% сахара. Через 24 ч после засева бродильнь1х растворов подрощенным мицелием начинали долины мелассного раствора. 25%-ного по сахару. Долины проводили

в два приема по 9,5 мл через 5 ч. Мелассцая среда для подращивания мицелия, г/л:

Меласса63,8

Ферроцианид калия 0,21 Углекисльй натрий безводный0,09

Щавелевокисльй аммоний 1,26 Однозамещенный фосфат калия0,16

Сульфат цинка водньй 0,005 Сульфат магния водный 0,25 Для ферментации среда приготавливается по тому же рецепту,г что и для подращивания, но не вводят сульфат магния.

Мелассная среда для долива, г/л: Меласса532,0

Ферроцианид калия 17,7 Процесс ферментации длился 5 сут За процесс с колбы получено 5440 кг общей кислоты, в составе кислот лимощ}ая составляет 79,8%, щавелевая 11,9%, глюконовая 8,3%, выход лимонной кислоты от сахара 67,2%.

Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлага- емой технологии ферментации концентрированных сред количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возросл

o

5

0

5

0

5

255,0 0,8

0,35 2,5

0,16 0,010

2212416

на J3,5%, а выход от сахара на 4,0%, при этом в составе синтезируемых -кислот отсутствует щавелевая кислота,

Пример 4. Процесс подра- 5 щивания посевного осуществляли,

как в примере 1. Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что для ферментации приготавливали мелассный раствор 12%-ный по сахару.

Рецепт мелассной среды дл ферментации, г/л:

Меласса

Ферроцианид калия

Углекислый натрий

безводньй

Щавелевокислый

аммоний

Однозамещенньй фосфат

калия

Сульфат цинка водньй

Из табл. 1 видно, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возрастает по сравнению с прототипом на 5,4%, а выход от сахара на 2,5%.

Пример 5. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли, как в примере 1. Процесс ферментации отличается от примера 2 тем, что для ферментации приготавливали мелас- сньй раствор с содержанием сахара 14%.

Рецепт мелассной среды для ферментации, г/л:

Меласса

Ферроцианид калия

Углекисльй натрий

безводньй

Щавелевокисльй аммоний

Однозамещенньй фосфат

калия

Сульфат цинка водньй

Данные табл. 1 показывают, что при ведении процесса по предлагаемой технологии количество лимонной кислоты, полученное с колбы, возрастает по сравнению с прототипом на 18,2%.

298,0 1,0

0,41

0,16 0,10

. Пример 6. Процесс подращивания посевного мицелия осуществляли, как в примере 2. Процесс ферментации отТтичается от примера 2 тем, что количество вносимого сернокислого цинка в мелассньй раствор равнр оптимальной дозе, установленной для разбавленных сред (5 мг/л). Данные табл. 1 показывают, что при такой подготовке сред.усиливается синтез глюконовой кислоты и снижается биосинтетическая активность гриба, в результате количество лимонной кислоты, полученной с колбы, возрастает лишь на 2,7%, а выход от сахара снижается на 4,5% по сравнению с прототипом.

Пример 7. Процесс подращивания посевного мицелия и ферментаци осуществляют, как в примере 2 (табл. 1). Отличие состоит в том,- что количество сернокислого цинка, вносимого в мелассную ферментационную среду, увеличивается по сравнени с оптимальной дозой, установленной для разбавленньк сред, в 3,4 раза и составляет 17 мг/л. При такой подготовке сред гриб активно синтезирует органические кислоты, причем в основном лимонную кислоту (88,8%), в результате количество лимонной кислоты по сравнению с прототипом возрастает на 15,5%, а выход от сахара на 3,7% (табл. 1).

Пример 8. Процесс подращивания посевного мицелия и ферментаи 1 осуществляют, как в 2. Отличие состоит в том, что количество сернокислого цинка, вносимого в ме- лассную среду для ферментации, превышает норму, установленную для разбав ленных сред, и составляет 15 мг/л . При такой подготовке сред активность гриба повышается, увеличивается содержание лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот, в результате количество лимонной кислоты по сравнению с прототипом повышается на 16,2%, а выход от сахара на 4,5% (табл. 1).

Следовательно, при обработке ме- лассных сред повьппенной концентрации ПЦСА (в дозе, необходимой для выведения половины солей кальция, содержащихся в мелассе) доза вносимого сернокислого цинка должна быть увели- чена по сравнению с дозой, установленной для разбавленных сред, и составляет 10-17 мг/л.

Пример 9. Культивирование осуществляли в производственньк условиях. В качестве продуцента использовали осмофильный штамм Aspergillus niger Л-4. Для подращивания мицелия приготавливали 3 м- мелассной среды, содержащей 5% сахара.

Состав среды для подращивания мицелия, г/л:

j

0 5 0

5 о

,

5

0

5

Меласса 46%-ная

по сахару108,7

Щавелевокислый

, аммоний3,66

Ферроцианид калия О ,,46 Сульфат магния 0,23 Фосфорнокислый калий 0,116 Сульфат цинка,

гидрат0,01

Фурациллин0,017

, Мелассу разбавляли в 2 м горячей воды в варочном котле и кипятили 10 мин. Затем добавляли щавелевокислый аммоний, кипятили 5 мин, вносили ферроцианид калия и кипятили еще 5 мин. После внесения сернокислого магния раствор через стерили- зационную систему подавали в посевной ферментатор емкостью 5 м. В мелас- сный раствор, охлажденный до 38 С, вносили стерильные растворы питательных солей фосфорнокислого калия и сернокислого цинка и антисептик фура- циллин. Засев среды производили конидиями гриба в количестве 3 г предварительно (за 6 ч до посева), замоченных в мелассной среде того же состава.

Ферментацию проводили в 50 м ферментаторе на среде, содержащей 13% сахара.

Состав среды для ферментации, г/л:

Меласса 46%-ная по сахару,282,0 ,

Щавелевокислый

аммоний3,33

Ферроцианид калия 1,03 Фосфорнокисльй калий 0,106 Сульфат цинка, гидрат 0,02 Раствор, приготовленный в 50 м ферментаторе, засевали мицелием гриба Aspergillus niger штамма Л-4, выросшим в посевном ферментаторе за 24 ч.

В процессе ферментации мелассный раствор не подливали. В связи с тем, что в процессе ферментации происходит испарение, производят долив стерильной воды дваяды по 2-2,5 м, обеспечивая лучшее эрлифтное перемешивание и более полное усвоение субстрата.

В процессе ферментации соблюдали следующий режим аэрации: первые 3 ч на ферментатор подают 200-300 м в час воздуха, через 3-6 ч 300-600 м в час, через 12 ч 600-800 м в час.

- 9

через 20 с 800-1000 м в час и через сутки 1100-1200 м в час. На этом уровне аэрацию сохраняли до конца цикла.

Процесс ферментации заканчивают при содержании сахара в ферментируемой среде 0,2%. Длительность ферментации 4,9 сут.

Контролем служил процесс, осу- ществляемьй по известному способу, принятому за прототип, на разбавленных средах, при котором в качестве продуцента применяли производственный штамм Aspergillus niger Л-1.

Результаты представлены в табл.

При ведении процесса по предлагаемой технологии за цикл с ферментатора получено 3014 кг лимонной кислоты. В составе синтезируемых кислот содержалось 88,3% лимонной кислоты и 11,6% глюконовой кислоты щавелевая кислота не синтезировалас

Съем лимонной кислоты составил 11,2 кг с 1 м в сут, выход лимонной кислоты от сахара мелассы 73,6%. Для получения. 1 т лимонной кислоты затрачено 2952 кг 46%-ной по сахару мелассы.

При ведении процесса по прототипу за 5,0 сут с ферментатора получено 2748 кг лимонной кислоты. В составе синтезируемых кислот содержалось 85,9% лимонной кислоты, 10,0% щавелевой кислоты и 4,1% глюконовой кислоты. Съем лимонной кислоты с 1 м в сут 10,0 кг, выход лимонной кислоты от сахара мелассы 77,4%. На получение 1 т лимонной кислоты затрачено 2808 кг 46%-ной по сахару мелассы.

Пример 10. Процесс осу-, ществляют, как в примере 9. Отличие состоит в том, что долив стерильной воды начинают с третьих суток. По результатам, представленным в табл. 2, видно, что при таком веде2124110

НИИ процесса по сравнению с прототи- пом сокращается длительность цикла,

увеличивается съем лимонной кислоты, однако значительно снижается выход 5 от сахара.

Пример 11. Процесс осуществляют , как в примере 9. Отличие состоит в том, что долив стерильной воды начинают с четвертых суток. По

10 результатам, представленным в . табл. 2, видно, что при таком ведении процесса резко ухудшаются все показатели процесса как по сравнению с прототипом, так и в случаях когда

15 долив стерильной воды начинают на 2-3 сут (см. табл. 2, пример 9 и 10).

Таким образом, предложенный способ позволяет ферментировать мелас- сные среды повышенной концентрации,

0 при этом съем лимонной кислоты с 1 м в сутки возрастал На 11,2%.

Отсутствие щавелевой кислоты при ведении процесса по предлагаемой технологии исключает образование

5 оксалата кальция при переработке сброженных растворов, вывоз оксалата кальция и связанные с этим транспортные расходы. Ведение процесса без

. доливов мелассных растворов з ень0 шает трудозатраты на стерилизацию подливных емкостей, приготовление подливньк растворов мелассы и ведение дробных доливов за время ферментации. При этом уменьшается расход

5 воды и пара. Исключение операции по доливу сред уменьшает возможность попадания посторонней микрофлоры, в результате чего улучшаются технико-экономические показатели.

0

Применение предлагаемой технологии на проектируемых заводах уменьшает капитальные затраты на оборудование бродильных цехов подливными 5 ёмкостями и высвобождает производ- : ственные площади.

п) cf s t;

Ю nJ H

oo

(У1 CM

r

in

fsl

a

CO

ts r

-

1Л

(Ti vO

r

vO

CSJ v)

О

r

o

CM CM

Ы

о о

ЧГ Ю

о о -

VO

2 Ш

д)

п) а R и

51 &

0-)

4D

оо

Прототип

11редла:гаемый по примеру

10,0

77,4

5,5

3200

2748

Продолжение та бл.2

7716

2808