Штамм гриба aSpeRGILLUS NIGeR л-4 продуцент лимонной кислоты Советский патент 1982 года по МПК C12N15/00 C12P7/48 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической просветленности и касается нового штамма гриба вида Asperglllus nlfjer, продуцирующего лимонную кислоту . Известны штаммы грибов АзрегдЯlus nineг Р-1 и Л-106, используемые для получения лимонной кислоты повер ностным способом f11 и 2j. . Продолжительность прорастания конидий у этих штаммов составляет 9 ч. За это время развивается сопутствующая микроОлора, угнетающая кислотообразование основного продуцента. Известен штамм Asperrjillus niger Л-1, используемый как продуцент лимонной кислоты в производственных ус ловиях . Однако этот штамм применим лишь для меласс с низкой исходной концент рацией по сахару. Цель изобретения - получение штам ма, обладающего высокой активностью образования лимонной кислоты при сбраживании мелассных растворов с вы сокой исходной концентрацией. был получен в результате селекции штамма Л-1 под- влиянием комбинированного действия химических и Аизических мутагенных факторов: диазоацетилбутана (ДАВ) и УФ-лучей, диэтилсульфата (ДЭС) и УО-лучей, циклоАосфана (ЦА) и УФ-лучей. После каждого способа обработки изучали кислотообразооание у 100 мутантов. Наиболее эффективным оказалось комбинированное воздействие раствором ДАВ в течение 3 ч и |уф-облучение в дозе 3,3 тыс.эрг/мм Таким образом, был селекционирован мутант N , называемый далее штаммом Л- (Ленинградский-). Новый штамм обильно образует конидии бежевого цвета, явлшгициеся посевным материалом в производстве лимонной кислоты; конидии прорастают через 6-7 ч. Птамн является более устойчивым к бактериальной флоре, сопутствующей производству лимонной кислоты, по сравнению с производстве ным штаммом Л-1. Птамм Л- является активным продуцентом лимонной кислоты как при по верхностном культивировании, так и в глубинных условиях при сбраживании мелассных сред повышенной концентреции, при этом лимонная кислота а сост ве синтезируемых кислот составляет 75-90%. Штамм Л- является активным кисло тообразователем при поверхностном и глубинном культивировании на средах приготовленных из мелассы. При культивировании в глубинных условиях на концентрированных мелассных средах штамм - образует 9, кг лимонной кислоты с 1 м в сутки, рас ход 6% мелассы на 1 т лимонной кислоты - 2959 кг. При поверхностном культивировании на мелассных средах штамм Л- об разур.т 2,026 кг лимонной кислоты с 1 сутки, расход 6% мелассы на 1 т лимонной кислоты составляет 3173 кг. Выход ли юннoй кислоты от сахара составляет (при использовании штамма Л-) 75% в глубинных условиях и 69 при культивировании поверхностным способом. Образование лимонной кислоты у штамма Л-Ц изучено при различных режимах ведения процесса: в лабораторных опытах в глубинных условиях выращивания на мелассных средах с содержанием сахара 10 и 13% (табл. 1); в лабораторных опытах в глубинных условиях на разбавленных до 3% по сахару мелассных средах по заводской технологии (табл, 2); в производственном цикле в цехе глубинной фep eнтaции Ленинградского комбината по производству лимонной кислоты на мелласных средах с исходной концентрацией сахара 10% (табл. в лабораторных условиях при поверхностном выращивании на стаканах на мелассных средах, по сахару. Результаты испытаний предлагаемог штамма Л- по сравнению с известным Л-1 сведены а табл. 1тЗ. Из таблиц следует, что штамм Л- является более активным киалотообразователем при всех испытанных режимах по сравнению с производственными штаммами. Продуктивность нового штамма на концентрированных средах, содержащих 9-15% сахара, возрастает на 11-29% По сравнению с активностью производственного штамма Л-1 в тех же условиях. Птамм гриба Asperglllus niger Л- депонирован во ВНИИГенетика под номером F-171. Штамм имеет следующую характеристику. Морфолого-физиологические признаки. Мор(юлогические свойства изучают у пятисуточных культур, выращенных при на среде Чапека. Конидиальные головки круглой ЙОР мы, диаметр их сечения мкм, средний головок 90,1 мкм. Зздутие конидиеносца (пузырек) шаройидной формы диаметром от 20 х 29 до ь8-60 мкм, средний диаметр ( х Зб мкм. Стеригмы двуслойные: длина стеригм парного порядка 6-32 мкм, в среднем 13,3 мкм. Стеригмы второго порядка длиной 5-10 мкм, в среднем 6,5мкм. Конидии круглые с толстой шиповидной кремовой оболочкой. Средний диаметр конидий ,1 мкм. Конидиеносцы прямые бесцветные, длина конидиеносцев tlS1265 мкм, ширина 9-20 мкм. Антагонистические свойства штамма л-4. Подавляет развитие бактерий E.coti, Bacitlus subtitls, flacijtus mesentericus, сопутствующих производству лимонной кислоты, и является более сильным антагонистом по отношению к этой микрофлоре по сравнению с производственным штаммом Л-1. Культуральные и (биохимические признаки. Сусло-агар. Колония быстрорастущая, достигающая на 5-е сутки в диаметре в среднем 8,6 см. Окраска колонии светло-бежевая. Воздушный мицелий сильно развит. В центре колонии конидиальные головки расположены плотно. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,6, см светлая зона с незрелыми белыми конидиальными головками плотно прижатыми к субстатному мицелию. Обратная сторона колонии гладкая белая. Среда Чапека. Колонии диаметром 6,1 см. Окраска колонии бежевая. В центре колонии конидиальные головки крупные, расположены плотно, образу ют возвышение. К краю колонии велич на конидиальных головок уменьшается Нарастающий край в радиусе 0,5 см покрывают незрелые мелкие конидиаль головки. Обратная сторона колон гладкая белая. В отличие от производственного штамма Л-1, новый штамм Л-f образуе более мелкие колонии. Мор(1юлогически отличается от производственного штам 4а несколько меньшими размерами конидиальных головок и более длинны ми стеригмами первого порядка. Ъвый штамм является более сильн антагонистом (по сравнению с исходным ) по отношению к сопутст вущей бактериальной флоре. Пример 1. Выращивание кислотообразующего мицелия и биосинтез )нной кислоты осуществляли в лабораторных условиях на качалке типа АВУ-50р с числом качаний 160 в мин в колбах емкостью 700 см при . Мелассный раствор П|ш1готваливали со гласно технологической конструкции Ио производству пицевой лимонной Ю1 ЛОТЫС1970 г.) . Опыты проводились на мелассе Ленинградского сахарного завода заготовки 1977 г. Меласса имела следующую характеристику: сахароза СаО 0, сухие вещества 75. доб рокачественность 63,5%( рН ,35. В отличие от производственно ч} культивирования, подращивание ницет проводили на мелассных средах« содержащих 5« сахарау а брожение на 10%-ных по сахару мелассных средах. Состав сред для подращивания спор г/л: Меласса10 Оерроцианид калия 0,25 Углекислый натрий безводный 0,32 1|авелево кислый аммоний2,01 Однозамещенный ()осфат калия 0,16 Сульфат цинка водный 0,005 Сульфат магния водный 0,25 Состав среды для бромения следующий, г/л: Меласса208 ()ерроцианид калия 0,5 Углекислый натрий, безводный О,65 Однозамещенный фосфат калия 0,16 Сульфат цинка водный0,005 Для приготовления споровой суспензии 0,1 г спор Aspergillus nlfier замачивали в 10 мл мелассного раствора в течение 1 ч при , Приготовленный 5%-ный мелассный раствор для подрас ивания разливали в колбы по 50 мл и засевали 10 мл Споровой суспензии. В этой среде споры подращивали 2( ч. Подрощенный мицелий служил посевным материалом для засева бродильных сред. Бродильные мелассные среды с содержанием сахара 10% разливали в колбы по 50 мл и вносили в них по 10 мл подоощенного мицелия. Весь процесс брожения протекал на исходном бродильном растворе без дополнительных дробных доливое питательной среды и заканчивался через 5 сут (табл. 1), Контролем служили варианты опытов, в которых процесс брожения осуществлялся в тех же условиях, но возбудителем брожения служил производственный штамм Л-1 (табл. 1). Испытания показали, что на мелассных средах с,содержанием сахара 10%j селекционированный штамм Л- увеличивает съем лимонной кислоты на 12,9« и дает эконокмю основного сырья мелассы на 11,% по сравнению с исходным штаммом Л-1, культивируемым в тех же условиях. Пример 2. Подращивание мицелий проводили на мелассных средах, содеращих 5% сахара, на брожение использовали мелассные среды с содержанием сахара Т3%. Для подращивания использовалась 5%-ная по сахару мелассная среда, изприготовленная согласно примера 1. Для брожения приготавливали 13%-ную по сахару мелассную среду, содержащую, г/л: Меласса270 Ферроцианид калия 0,65 Углекислый натрий безводный 0,65 ,7 , 9 Однозамещенный фосфат калия 0,16 Сульфат цинка водный0,005 В остальной процесс проводили по технологии, описанной в примере 1. йри ведении процесса брохсения на (по сахару) меласснЬм растворе (табл. 1} штамм Л- увеличивал съем лимонной кислоты на и сни Ьал расход основного сырья мелассы Иа tSiH по сравнению со штамМом Л-1, купьтивируе «)м в тех же условия Пример 3. Процесс лимоннокислого брожения осуществляли в глубинных условиях (не по технологии, принятой в настоящее время на заводах по производству лимонной кислоты). Дпя подращивания спор приготавливали по сахару мелассный раст .вор, содержащий, г/л5 Меласса62 Ферроцианид калия 0,15 Углекислый натрий безводный 0,15 Г1авеле во кислый аммоний1,2 Однозамещенный фосфат калия 0,16 Сульфат цинка водный0,005 Сульфат магния водный0,25 Для брожения приготавливали по сахару бродильную среду (состав среды для подращивания), но без добавления сульфата магния и щавелевокислого аммония. Состав среды для подлива,, г/л: меласса 521,0; ферроцианид калия 1,25. Подращивание мицелия вели в одну стадию на (по сахару) мелассном растворе. На брожение приготавливали (по сахару) мелассный раствор. Через 2 м после засева бро дильных растворов подрощенным мицелием Начинали дополнительные подливы мелассного раствора с содержанием (Л жара 25%. Подливы проводили 2 разаП по 18,8 МП через k ч (трбл. 2). При ведении процесса на разбавлен ных меласеныX средах у производствен NOго штамма Л-1 в составе синтезируемых кислот лимонная кислота составляла Bk,6%, у нового штамма Л- 90, ли1«юнной кислоты у штам8ма Л-1 - 9,fi г/см в сутки, у штамма Л-4 - 11,96 г/см в сутки. Экономия основного сырья мелассы у штамма n-k составляет 9,1. Пример t. Выравнивание кйсло тообразупщего «1целия штамма Л- и синтез лимонной кислоты осуществляли глубинным способом на концентрированной среде в производственных условиях в цехе глубинной ферментации Ленинградского завода по производству лимонной кислоты. На замачивание конидий, подраи вание посевного материала, ферментацию и на доливы использовали мeлafccный раствор, приготовленный из одной и той хе мелассы с отработанным для нее режимом приготовления сред. При ведении процесса с использованием штамма Л-k на концентрированной среда подращивание осуществляли в 5 м ферментаторах в 3 м- мелассной средм с содержанием сахара 5%. Через 2 ч подрощенный мицелий в объеме 3 м переводили в ферментатор брожения, содержащий 30 м 10%-ного по са хару мелассного раствора. В течение 3 сут объе раствора поддерживали на уровне 2 м, подливая стерильную воду. Через трое суток бал начат подлив мелассного раствора. Подлив проводили через 1,5 ч по 1000 л. С подливом внесено 1И8 кг сахара. При таком ведении процесса в составе синтезируемых кислот образовалось 77,6% лимонной кислоты. Объем лимонной |«1слоты с 1 м в сутки составил 9,31 кг, выход лимонной кислоты от сахара 71,1. Параллельно проводили контрольный цикл, в котором продуцентом являлся производственный штамм Л-1. При этом процесс лимоннокислого брожения осуществляли по известной технологии подращивание вели в 5 м Лпрментаторе на по сахару мелассной среде в течение 2k ч, затем 3 м подрощенного мицелия переводили в ферментатор брожения, содержаций 27 м Зо-ноf-o мелассного раствора. Через 2k ч ,ррожения был начат подлив 25%-ного по сахару мелассного раствора. Вводили по 1 м раствора через каждые 1,5 м. С доливамы внесено кг сахара. Длительность цикла составила 6,5 сут. При таком введении процесса 9 в составе синтезируемых кислот обра зовалось 80,3% лимонной кислоты. Сь лимонной кислоты с 1 м в сутки составил 8,6 кг, выход лимонной кисл ты от сахара 78,9. Испытание в производственных усл виях показало, что штамм Л- являет активным продуцентом лимонной кисло на концентрированной мелассной сред увеличивая съем лимонной кислоты на 9,2% по сравнению со штаммом Л-1, в ращенньм по заводской технологии. Пример 5 Испытание провод ли в лабораторных условиях поверхно ным бессменным способом. Состав мелассной среды следующий г/л: Свекловичная меласса (сахара в мелассе .7%)360,0 Карбонат натрия безводного0,8 йерроцианид калия 0,81 Фосфат калия одноза ющенный 0,111 Сульфат чинка 0,005 РИ 7,18 Мелассную среду в количестве 500 мл (толщина слоя 12 см) наливал в химические стаканы с дна 0,41 дм Конидии штамма Л- высева ли на поверхность среды. Продолжительность подрасчивания 8 сут, темпе ратура . Параллельно выращивали производствен 1ый штамм Р-1 при оптимальном для него режиме. Рецепт мелассной среды для штамма Р-1 следующий, г/Л Свекловичная меласса (сахара в мелассе ,7)330 Карбонат натрия безводный0,9 Ферроцианид калия 1,3 Фосфат калия однозамещенный 0,11 Сульфат цинка 0,005 рИ 7,2 По окончании опыта у штамма Лполучено 78,16 г лимонной кислоты в среднем на один стакан. Съем лимо ной кислоты в пересчете на 1 м в сутки соста 1Л г, выход от саixapa 69%. 9 У производственного штамма Р-1 получено 5,12 г лимонной кислоты в среднем на один стакан. Събм лимонной кислоты с 1 м в сутки составил 1650 г, выход лигюнной кислоты от гахара 69%. Таким образом, предлагаемый штамм Aspergillus nlfjer Л- является высокоактивным кислотсюбразователем по сравнени) с применяемым произведетвеннът штангюм Л-1, Р-1.и Л-106 при культивировании на средах из меласс глубинным и поверхностным способом. В глубинных условиях на разбавленных мелассных средах (по применяемой технологии) штамм П-k обеспечивает увеличение объема лимонной кислоты на 21,0 и экономию мелассы по сравнению со штаммом Л-1, применяем ш в производстве по той же технологии на 18,1%. В глубинных условиях на концентрированных средах из мелассы, содержащей 9-13% сахара, штамм Л-4 обеспечивает увеличение объема лимонной кислоты по сравнению со штаммом Л-: 1, шращенным в тех же условиях на 12, а экономию мелассы - на 11,,1% Кроме того, применение штамма Л- на концентрированных средах значительно снижает трудоемкость технологического процесса: сокращается число варок подливных мелассовых растворов, требуются меньшие емкости для приготовления и хранения растворов; уменьшается вдвое количество подливов и необходимость проведения их в период когда продуцент особенно подвержен инфицированию. О поверхностных устювиях культивирования на средах из мелассы, со- держащей сахара, штамм Пг-k увеличивает съем лимонной кислоты гю сравнению со штаммами Р-1 на 23,7%. Преимущество штамма Л- состоит и в том, что ксжидии этого штамма прорастают через 7 ч, а у штаммов Р-1 и Л-106 - через 9-10 ч. Применение нового штамма Л- дает возможность перейти к сбраживанию мелассных сред с повышенным содержа нием сахара в исходных растворах, используемых на брожение, что приведет к интенсификации лимоннокислого брожения гяубитл4М способом.

in

о

соо

сог-in

.смоо

1Л

«с

оj I

-f гг

ГО«.

«о

«м

о

с

оо

S

-9см

гд

Г|

со

о о о со

0

IV. о

fr

чО

m

ОО СП

о

-

SM

г « РЛ

1Л .-а«f 1Л

см«

-оосг

-4- - .СО

и

г

о

л 1Л

« -а- i I I I I J

с; е; с; с; I

1

k

-3vO

CM vO

Сч|

о

0%

с;

««

(О

ar s t; Ю

n

U

r -

-

oo «

r

CTl

я

чО

in

CM ОЛ

CM

«Ч

(П

0-1 чО

СЛ

OQ

J1Л

« NC

a

C9

,o eo

r

tn

k

M

15 9757996

формула изобретения1. Авторское С1Л1двтельство СССР

Штамм гриба AsperglHus nlger Л- -N360677. кл. П 12 Р 7АП, 19/5. (коллекция Центрального музея промышMouuur °°и ° Института;,. Авторское свидетельство СССР

шпм ° 778260. кл. С 12 N 15/00

ЦМПМ F-171) - продуцент лимонной кис-1979 -

лоты.

Источники информации,3. Авторское свидетельствоСССР

Принятые во внимание при экспертизеN , кл. С 12 N 1/1, 1971.