СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Советский патент 1995 года по МПК C12P7/48 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения лимонной кислоты на средах, содержащих дефектную тростниковую мелассу, методом глубинной ферментации гриба Aspergillus niger. Лимонная кислота широко применяется в пищевой промышленности.

Известен способ получения лимонной кислоты из тростниковой мелассы, предусматривающий ее обработку солью цианистого железа и ферментацию при исходном рН среды 6-9 с целью сохранения сахара в мелассе при стерилизации. Процесс проводят при концентрации сахара 12% в течение 3-6 сут. Съем лимонной кислоты через 6 сут составляет 9-10 кг/м^3.сут.

Недостатками способа являются большая энергоемкость процесса, связанная с необходимостью высокой степени очистки мелассы, и невысокие технико-экономические показатели всего процесса. Кроме того, срок хранения мелассы, используемой в процессе, не должен превышать 6 мес.

Известен способ получения лимонной кислоты, предусматривающий следующие приемы. Свекловидную массу разводят горячей водой (80^оС) в соотношении 1:1 и последовательно обрабатывают определенными дозировками гексацианоферроата калия (K₄[Fe(CN₆)] ^. 3H₂O, желтая кровяная соль, или ЖКС) и щавелевокислого аммония (ЩКА). В обработанный таким образом раствор вводят необходимые питательные соли, в частности, источники азота, фосфора, стерилизуют и используют для культивирования штамма гриба-продуцента Aspergillus niger.

В дальнейшем культивирование осуществляют следующим образом. Предварительно замоченные споры гриба подращивают глубинным способом в питательной мелассной среде определенного состава, содержащей источники азота, фосфора, магния, цинка; подрощенный глубинный мицелий переводят в питательную мелассную среду для биосинтеза лимонной кислоты, содержащую источники азота, фосфора, цинка.

В период ферментации производят подлив мелассного раствора, обработанного ЖКС, до суммарной концентрации сахара 120-150 г/л. Длительность культивирования 5-7 сут, температура ферментации 32^оС. Способ осуществляют в условиях интенсивной аэрации культуральной жидкости. Этот способ используется в качестве промышленного для получения лимонной кислоты. Съем лимонной кислоты составляет 11,07 кг/м^3.сут. Недостатком способа является то, что он непригоден для переработки сырой неочищенной дефектной тростниковой мелассы. В процессе ферментации дефектной тростниковой мелассы отечественными штаммами Aspergillus niger по известному способу резко увеличивается вязкость культуральной жидкости, содержание сырой биомассы в культуральной жидкости возрастает на 30% падает удельная кислотообразующая активность мицелия. Процесс останавливают на 3-4-е сутки из-за нецелесообразности дальнейшего ведения. Съем лимонной кислоты на дефектной тростниковой мелассе снижается на 42%
Целью изобретения является упрощение способа за счет использования мелассы длительного хранения.

Как известно, тростниковая меласса имеет небольшой срок хранения (6-7 мес).

При более длительном хранении у тростниковой мелассы снижается сумма ферментируемых сахаров, повышается буферность, увеличивается микробная обсемененность, возрастает количество коллоидных веществ (см. табл. 1).

В процессе длительного хранения происходит реакция Майяра между имеющимися в мелассе аминокислотами и редуцирующими сахарами с последующей полимеризацией в соединения желтого цвета меланоиды, которые в дальнейшем значительно повышают цветность мелассных растворов выше нормативов.

Меласса с такими показателями непригодна для биомассы лимонной кислоты, т.е. является дефектной.

Таким образом, в соответствии с требованиями, предъявляемыми к сырью для использования при производстве лимонной кислоты, доброкачественная тростниковая меласса должна иметь следующие показатели: Цветность, усл.ед, Не более мл 0,1 н. раствора J₂ 2,6 Буферность, мл 1 н. Не более раствора H₂SO₄ 44,0 Содержание коллоид- Не более ных веществ, 12,0
Значения цветности 2,7-4,3 усл.ед. буферности 44,1-51,6 мл 1 н. раствора Н₂SO₄ и коллоидности 12,1-13,4% характеризуют дефектную тростниковую мелассу.

Способ заключается в следующем. Осуществляют разведение мелассы горячей водой в соотношении 1:1, последовательную обработку ЖКС и ЩКА, введение питательных солей, стерилизацию и культивирование штамма гриба-продуцента A. niger ВКПМ F-326 (Л-5) глубинным способом. При этом в дефектную тростниковую мелассу после обработки ЖКС и ЩКА вводят питательные соли, выбранные из группы, включающей калий-никель (II) хлористый двухводный (KNiCl₃x2H₂O) или калий-медь (II) хлористую двухводную (K₂CuCl₄x2H₂O), или калий-магний хлористый шестиводный (KMgCl₃x6H₂O), или калий-цинк хлористый (KZnCl₄) в количестве 0,2-0,3 г/л и проводят ферментацию при содержании растворенного кислорода в среде 80-85% от насыщения.

Проведены сравнительные испытания недефектных тростниковой и свекличной меласс при ферментации известным и предлагаемым способами, а также испытания дефектной тростниковой мелассы с введением в питательную среду каждой из предложенных солей без изменения известного режима снабжения кислородом среды: содержание растворенного кислорода 3-5 г/л, что составляет 60% от насыщения.

Предлагаемые соли практически не влияют на процесс ферментации при использовании недефектных тростниковой и свекличной меласс.

Одновременное воздействие на процесс ферментации недефектной тростниковой мелассы двух факторов (предложенной соли и режима снабжения среды кислородом) также практически не влияет на активность процесса биосинтеза лимонной кислоты.

Введение в питательную среду, содержащую дефектную тростниковую мелассу, предложенной соли без изменения режима снабжения среды кислородом повышает на 5-8% в среднем съем лимонной кислоты, но при этом на 34% не достигает уровня съема лимонной кислоты, полученной из недефектной тростниковой мелассы. Изменение режима снабжения кислородом питательной среды (от 60 до 80-85% от насыщения) не влияет на выход лимонной кислоты при переработке недефектной тростниковой мелассы, снижает выход для свекловичной мелассы и повышает съем на 7-12% при переработке дефектной тростниковой мелассы.

Лишь одновременное воздействие на дефектную тростниковую мелассу обоих факторов (введение одной из предложенных минеральных солей и изменение режима снабжения среды кислородом) обеспечивает синергический эффект увеличение съема лимонной кислоты и увеличение массовой доли лимонной кислоты (см. табл. 2 и 3).

Как видно из результатов, приведенных в табл. 3, ведение процесса при содержании растворенного кислорода на уровне 80-85% насыщения и использование предложенных комплексных солей в концентрации 0,2-0,3 г/л обеспечивает увеличение съемов лимонной кислоты на 9-1% в сравнении с известным способом при использовании свекловичной мелассы и на 114-119% по сравнению с контролем при использовании дефектной тростниковой мелассы.

Снижение концентрации солей и содержания растворенного кислорода до значений ниже минимальных снижает массовую долю лимонной кислоты в сумме кислот за счет образования других кислот, что приводит к снижению съема лимонной кислоты на 5-10%
Увеличение концентрации комплексных солей и содержания растворенного кислорода до значений выше максимальных, по-видимому, ингибирует активность фермента цитратсинтетазы, что также приводит к снижению съема лимонной кислоты на 7-10%
П р и м е р 1. Способ осуществляют в соответствии с технологической инструкцией по производству лимонной кислоты. В качестве сырья используют свекловичную мелассу. Продуцент лимонной кислоты штамм гриба A. niger ВКПМ F-326. Процесс ведут на установке управляемого культивирования АК-210, объем аппарата 10 л. Исходный объем среды 6,0 л.

Способ осуществляют в три стадии.

1. Замачивание спор. Сухие споры гриба-продуцента замачивают в течение 6 ч в синтетической среде следующего состава, г/л: сахароза 50,0; NH₄NO₃ 2,5; KH₂PO₄ 0,16; MgSO₄ x 7H₂O 0,25.

2. Выращивание посевного мицелия. Замоченные споры переводят в мелассную среду для глубинного подращивания следующего состава, г/л: сахар мелассы 30,0; MgSO₄^. 7H₂O 0,25; KH₂PO₄ 0,16; ZnSO₄ x x7H₂O 0,005.

3. Ферментация. Посевной мицелий переводят в мелассную среду для биосинтеза лимонной кислоты следующего состава, г/л: сахар мелассы 30,0; KH₂PO₄ 0,16; ZnSO₄ x x7H₂O 0,005.

Для подращивания и ферментации используют среды из свекловичной мелассы, обработанные ЖКС и ЩКА. Обработку мелассы проводят следующим образом: мелассу разводят горячей водой в соотношении 1:1, при 80^оС обрабатывают ЖКС из расчета 466 мг на 100 г мелассы, а затем ЩКА из расчета 4,56 г на 100 г мелассы. После обработки мелассный раствор разводят водопроводной водой с таким расчетом, чтобы концентрация сахара в нем составила 30 г/л.

Длительность ферментации 5 сут, температура 32^оС, содержание растворенного кислорода в культуральной жидкости 60% Съем лимонной кислоты составляет 11,07 кг/м^3.сут.

П р и м е р 2. Поступают аналогично примеру 1, но в качестве сырья используют тростниковую мелассу со сроком хранения 1 мес. Съем лимонной кислоты составляет 9,74 кг/м^3.сут.

П р и м е р 3. Действуют аналогично примеру 1, но в качестве сырья используют дефектную тростниковую мелассу со сроком хранения 10 мес. Съем лимонной кислоты составляет 5,65 кг/м^3.сут.

П р и м е р 4. Действуют по предлагаемому способу В качестве сырья используют дефектную тростниковую мелассу со сроком хранения 10 мес.

Продуцент лимонной кислоты штамм гриба A.niger ВКПМ D-326. Предварительно перед приготовлением питательных сред дефектную тростниковую мелассу подвергают кислотно-тепловой обработке. Мелассный раствор в соотношении 1:1 обрабатывают 10% -ной серной кислотой до рН 4,65, выдерживают при 70-80^оС в течение 1 ч. Затем раствор охлаждают до 40^оС и отделяют отстоявшийся осадок. Из обработанной мелассы приготавливают питательные среды для подращивания посевного материала, ферментации и подлива.

Подращивание посевного материала ведут в среде следующего состава, г/л: Сахар мелассы 25,0 KH₂PO₄ 0,16 ZnSO₄^. 7H₂O 0,005 MgSO₄^. 7H₂O 0,25
Дозировки феррицианида калия (ЖКС) и щавелевокислого аммония (ЩКА), мг/100 г мелассы: ЖКС 900, ЩКА 2990.

Для ферментации используют среду следующего состава, л: Сахар мелассы 25,0 NH₄NO₃ 1,5 KH₂PO₄ 0,16
Дозировка ферроцианида калия и щавелевокислого аммония, мг/100 г мелассы: ЖКС 766; ЩКА 1450.

Дополнительно в состав питательной среды для ферментации вводят комплексную соль калий-медь хлористый двухводный (K₂CuCl₄) x 2H₂O в количестве 0,25 г/л.

Длительность ферментации 5 сут. Температура ферментации 28^оС. Содержание растворенного кислорода в культуральной жидкости 80% Съем лимонной кислоты составляет 12,35 кг/м^3.сут.

П р и м е р 5. Действуют аналогично примеру 4, но в питательную среду вводят 0,25 г/л комплексной соли KNiCl₃ x 2H₂O. Съем лимонной кислоты составляет 12,31 кг/м^3.сут.

П р и м е р 6. Поступают аналогично примеру 4, но в питательную среду вводят 0,25 г/л комплексной соли K₂ZnCl₄. Съем лимонной кислоты составляет 12,31 кг/м^3.сут.

П р и м е р 7. Поступают аналогично примеру 4, но в питательную среду вводят 0,25 г/л соли KMgCl₃ x 6H₂O. Съем лимонной кислоты 12,31 кг/м^3.сут.

Предлагаемый способ позволяет перерабатывать тростниковые мелассы со сроком хранения 10 мес, что имеет большое значение для бесперебойного обеспечения производства лимонной кислоты сырьем и снижает потери мелассы на 45,7%

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения лимонной кислоты на средах, содержащих дефектную тростниковую мелассу, методом глубинной ферментации гриба Aspergillus niger. Лимонная кислота широко применяется в пищевой промышленности. Целью изобретения является упрощение процесса за счет использования мелассы длительного хранения. Способ заключается в разведении дефективной тростниковой мелассы, имеющий цветность 2,7-4,3 усл. ед. буферность 44,1-51,6 мл 1 н. раствора H₂SO₄ и коллоидность 12,1-13,4% горячей водой в соотношении 1 1, последовательной обработке желтой кровяной солью и щавелекислым аммонием, введении источников азота, фосфора и комплексных солей [калий никель II хлористый двуводный или калий-медь II хлористая двуводная, или калий-магний хлористый шестиводный, или калий-цинк хлористый] в количестве 0,2-0,3 г/л и проведении ферментации при содержании растворенного кислорода в среде 80-85% от насыщения. Съем лимонной кислоты составляет 12,3 кг/м³·сут что снижает потери мелассы на 45,7% 3 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ, предусматривающий разведение мелассы горячей водой в соотношении 1:1, обработку раствора желтой кровяной солью и щавелевокислым аммонием, введение в него источников азота и фосфора, стерилизацию полученной среды и культивирование штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-326 в условиях аэрирования до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет использования мелассы длительного хранения, используют дефектную тростниковую мелассу, имеющую цветность 2,6-4,3 усл.ед. буферность 44,0-51,6 мл 1 н.раствора H₂SO₄, содержание коллоидных веществ 13,4% в среду дополнительно вводят калий-никель (II) хлористый двуводный или калий-медь (II) хлористую двуводную, или калий-магний хлористый шестиводный, или калий-цинк хлористый в количестве 0,2-0,3 г/л, аэрирование осуществляют со скоростью, обеспечивающей содержание растворенного кислорода в среде на уровне 80-85% от насыщения.