ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/14 C12P7/48 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения штамма гриба Aspergillus niger продуцента лимонной кислоты для глубинного культивирования на мелассных средах. Селекционированный штамм Aspergillus niger F-678 обладает высокой активностью образования лимонной кислоты при глубинном культивировании на разбавленных и концентрированных по сахару мелассных средах, продуцируя до 10,9 кг/м³ в сутки лимонной кислоты. При этом выход лимонной кислоты от редуцирующих веществ достигает 90,1%
Известен штамм гриба Aspergillus niger CCF-1599, селекционированный чехословацкими исследователями и способный в условиях глубинного культивирования на средах, содержащих 10 20% сахарного субстрата, в течение 5 7 сут ферментации синтезировать до 75% лимонной кислоты от введенного сахара.

Недостатком штамма CCF-1599 является его низкая промышленная эффективность [1]
Технико-экономические показатели известных штаммов, применяемых в странах СНГ в условиях производства лимонной кислоты методом глубинного культивирования, представлены в табл. 1.

Недостатком этих штаммов является короткая продолжительность периода активного кислотообразования, высокий расход сырья и низкий выход кислоты от сахара [2 4]
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-326 - продуцент лимонной кислоты, обладающий высокой активностью образования лимонной кислоты при глубинном культивировании на разбавленных по сахару мелассных средах, образуя до 9,9 кг/м³ в сутки лимонной кислоты. При этом выход от редуцирующих веществ составляет 88,2% Однако по технико-экономическим показателям прототип уступает новому штамму [4]
Целью изобретения является получение нового универсального штамма, имеющего более высокую активность по образованию лимонной кислоты как в условиях коротких циклов, так и при длительной ферментации разбавленных и концентрированных по сахару мелассных сред.

Новый штамм гриба Aspergillus niger F-678 получен методом ступенчатой селекции на основе мутагенеза с использованием мутагенов химической и физической природы из ранее применяемого промышленного штамма Aspergillus niger Л-1 с последующим стабилизирующим отбором спонтанных вариантов.

Штамм Asp. niger F-678 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ВНИИГенетика.

Штамм Asp. piger F-678 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки
Новый штамм на сусло-агаре через 5 сут культивирования образует колонии диаметром 6,7 см. Окраска колоний цвета слоновой кости. Воздушный мицелий развит слабо. Конидиеобразование обильное. Обратная сторона колонии гладкая. Конидиальные головки круглые, диаметром 135,4±12,5 мкм. Вздутия конидиеносцев шаровидные размером (37,5±3,9)•(35,8±3,7) мкм. Стеригмы двухслойные. Длина стеригм I порядка 9,1±0,9 мкм, второго - 5,9±0,4 мкм. Диаметр конидий 3,9±0,1 мкм. Оболочка конидий имеет окраску цвета слоновой кости. Конидиеносцы прямые бесцветные длиной 942±282 мкм, шириной 12,9±0,3 мкм.

Физиолого-биохимические признаки
Аэроб.

Температурный диапазон роста 22 38^oC.

Оптимальная температура роста 32±1^oC.

Оптимум pH 5,6 7,2.

Отношение к источникам азота: усваивает азот органических соединений, например пептон, белок, аминокислоты, дрожжевой автолизат, мочевину, а также ассимилирует азот минеральных солей, предпочтительнее соли аммония, нитраты.

Отношение к источникам углерода; хорошо усваивает и растет на мальтозе, глюкозе, сахарозе, фруктозе, D-ксилозе, D-маннозе, в меньшей степени усваивает декстрин, сорбит, крахмал, D-раффинозу и плохо растет на лактозе.

Хорошо хранится в виде высушенных конидий (до 5 10% остаточной влажности) или в виде культуры, выращенной на скошенном сусло-агаре.

Температура культивирования 32±1^oC.

Длительность культивирования 7 сут.

Температура хранения +18±1^oC.

Генетические особенности прототроф, осмофил.

Штамм Asp. niger F-678 идентифицирован по Определителю грибов рода Aspergillus [5]
Штамм F-678 отличается от родительского штамма Л-1 морфолого-культуральными признаками. В отличие от родительского штамма имеет более мелкие конидии, стеригмы I и II порядков и вздутия конидиеносцев. Конидиальная оболочка окрашена в цвет слоновой кости, т.е. практически лишена пигмента. У родительского штамма оболочка имеет темно-бежевый цвет.

Кроме того, селекционный штамм обладает высокой энергией прорастания конидий, т.е. время прорастания конидий штамма F-678 в сусле (7^o Б по сахару) 5 ч, в то время как у родительского штамма 7 ч.

При выращивании посевного мицелия (инокулюма) у селекционированного штамма накопление биомассы за счет быстрого прорастания конидий идет интенсивнее, что позволяет на 5 7 ч сократить время подготовки инокулюма.

Новый штамм уже в первые сутки процесса синтезирует преимущественно лимонную кислоту. Так, на третьи сутки в составе синтезируемых кислот на долю лимонной кислоты приходится 90 и более процентов, а у родительского штамма Л-1 около 80%
Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Asp. niger F-678.

Пример 1. Выращивание кислотообразующего мицелия и синтез лимонной кислоты осуществляли в лабораторных условиях на качалке с числом качаний 160±5 мин^-1 в колбах емкостью 700 см³ при 32±1^oC. Для выращивания посевного мицелия приготавливали мелассный раствор с концентрацией по сахару 30 г/дм³ следующего состава, г/дм³:
Меласса 60,0
Карбонат натрия 0,08
Гексацианоферроат калия, гидрат 0,14
Оксалат аммония гидрат (для полного осаждения солей кальция и магния из расчета на CaO) 2,13
Дигидроортофосфат калия 0,16
Сульфат магния, гидрат 0,25
Сульфат цинка, гидрат 0,005
Вода водопроводная остальное до 1 дм³
pH 6,7
Для ферментации приготавливали мелассную среду, содержащую 30 г/дм³ сахара, по рецептуре, приведенной выше, но без добавления сульфата магния. Состав среды для подпитки культуры, г/дм³:
Меласса 497,0
Гексацианоферроат калия, гидрат 1,18
Вода водопроводная остальное до 1 дм³
pH 6,0
Выращивание посевного мицелия осуществляли в 50 см³ мелассной среды путем засева ее гомогенной суспензией конидий из расчета 0,01 г/м³. Объем конидиальной суспензии 10 см³. Длительность выращивания посевного мицелия 24 ч. Подготовленный таким образом инокулюм служил посевным материалом для засева ферментационной среды. Затем в среду, приготовленную для ферментации, в объеме 50 см³³ вносили по 10 см³ посевного мицелия.

В процессе ферментации проводили подпитку культуры мелассным раствором, содержащим 250 г/дм³ сахара, в два приема: первую подпитку через 24 ч ферментации в количестве 10 см³, вторую через 32 ч. ферментации в количестве 9 см³. Процесс заканчивали через 5 сут.

В качестве контроля использовали известный производственный штамм F-326. Результаты испытаний представлены в таблице 2. Данные табл. 2 показывают, что у селекционированного штамма возрастает массовая доля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот на 5,4% съем лимонной кислоты на 13,7% а выход кислоты от сахара на 7,8%
Пример 2. Условия проведения и подготовки питательных сред те же, что в примере 1. Но изменена схема подпитки культуры: первый подлив через 24 ч ферментации в количестве 10 см³, второй через 30 ч. ферментации в количестве 9 см³, а затем по 4 см³ на 5, 6 и 7-е сутки ферментации. Процесс вели 9 сут. В качестве контроля (прототип) использовали тот же отечественный штамм F-326. Результаты опытов, представленные в табл. 2, показывают, что при длительных циклах у селекционированного штамма F-678 возрастает массовая доля (до 98,2% ) лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот. Образование лимонной кислоты с 1 м³ в сутки (съем) у нового штамма в этих условиях увеличивается по сравнению со штаммом F-326 на 8,4% а выход ее от сахара на 5,0% соответственно.

Пример 3. Условия проведения те же, что в примере 1. Выращивание посевного мицелия вели на мелассных средах, содержащих 50 г/дм³ сахара; ферментацию на мелассных средах с содержанием сахара 130 г/дм³ без дополнительной подпитки гриба.

Для выращивания посевного мицелия использовали мелассную среду состава, г/дм³:
Меласса 100,0
Карбонат натрия 0,13
Гексацианоферроат калия, гидрат 0,23
Оксалат аммония, гидрат 3,5
Сульфат магния, гидрат 0,25
Дигидроортофосфат калия 0,16
Сульфат цинка, гидрат 0,01
Вода водопроводная остальное до 1 дм³
pH 6,5.

Для ферментации применяли мелассную среду состава, г/дм³:
Меласса 260,0
Карбонат натрия 0,35
Гексацианоферроат калия, гидрат 0,610
Оксалат аммония, гидрат 4,6
Дигидроортофосфат калия 0,16
Сульфат цинка, гидрат 0,01
Вода водопроводная остальное до 1 дм³
pH 6,8.

Длительность ферментации 5 сут. Испытания показали, что на концентрированных по сахару мелассных средах с содержанием сахара 130 г/дм³ селекционированный штамм образует на 11,4% больше лимонной кислоты, чем известный штамм F-326 (табл. 3). При этом выход кислоты от сахара увеличивается на 6,1%
Пример 4. Выращивание посевного мицелия нового штамма и синтез лимонной кислоты осуществляли глубинным способом в производственных условиях по применению на Санкт-Петербургском заводе технологии. Контролем служил производственный штамм F-326.

На приготовление конидиальной суспензии, выращивание посевного мицелия, ферментацию и подписку культур обоих штаммов использовали мелассный раствора одного и того же состава. Посевной мицелий выращивали в посевных ферментаторах емкостью 5 м³. Объем мелассной среды 3 м³. Содержание сахара в ней 30 г/дм³. Через 24 ч выращенный мицелий переводили в ферментатор емкостью 50 м³, содержащий 27 м³ мелассного раствора с концентрацией сахара 30 г/дм³. Через 24 ч ферментации начинали подпитку гриба путем доливов мелассного раствора, содержащего 225 г/дм³ сахара, по 1 м³ через каждые 1,5 ч.

На четвертые и пятые сутки ферментации проводили отъем сферментированного раствора в количестве 5 м³. После чего в ферментатор вливали 2 м³ воды и 5 м³ мелассного раствора с концентрацией по сахару 225 г/дм³. Длительность процесса в опытных циклах составила в среднем 6,72 сут, в контрольных 6,69 сут.

В условиях производства у селекционированного штамма массовая доля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот в среднем из трех опытов достигала 90,9% масса лимонной кислоты с 1 м³ ферментатора в сутки - 10,93 кг, удельный расход 46%-ной по сахару мелассы на 1 т лимонной кислоты - 2412 кг, выход кислоты от сахара 90,13% (табл. 4). У промышленного штамма F-326 массовая доля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот в среднем из трех опытов составляла 89,7% продуктивность по массе лимонной кислоты с 1 м³ в сутки 10,21 кг,удельный расход 46%-ной мелассы на 1 т лимонной кислоты 2821 кг, выход лимонной кислоты от сахара 77,05%
Таким образом, новый селекционированный штамм в условиях производства образует на 7,0% больше лимонной кислоты с 1 м³ в сутки и дает экономию мелассы на 14,5 по сравнению с производственным штаммом F-326.

Следовательно, штамм F-678 обладает рядом приемуществ: более высокая продуктивность по лимонной кислоте и высокий выход ее от сахара до 90% и более обуславливает снижение основного расхода сырья и вспомогательных материалов; высокая энергия прорастания конидий позволяет снизить опасность вторичного инфициирования в период ферментации; большая технологичность нового штамма дает возможность увеличить конкурентноспособность его на мировом рынке.

Экономический эффект от использования штамма F-678 в производстве лимонной кислоты составит 10355 руб на 1 т лимонной кислоты (цены 1993 г).

Использование: биотехнология, получение лимонной кислоты. Сущность изобретения: новый штамм-продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-678, полученный из ранее применяемого штамма Aspergillus niger Л-1 методом ступенчатой селекции. При промышленном культивировании данного штамма конверсия сахара в лимонную кислоту достигает 90,1%. 4 табл.

Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-678 продуцент лимонной кислоты.