Способ получения иммуносорбента Советский патент 1986 года по МПК C08B15/06 

1

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно к способу получения высокоемкого иммуносорбента для специфического связывания антигена .

Йммуносорбенты, представляющи:е нерастворимую основу, к которой ко- валентной связью присоединяют антитела, нашли широкое применение лля специфического выделения как корпускулярных, так и молекулярных антигенов (клетки, вирусы, белки, полисахариды, биологически активные пептиды и др.).

Цель изобретения - повышение емкости иммуносорбента.

Пример 1. К 300 мг пористых целлюлозных шариков (ПЦШ) добавляют 30 мл 0,1 М WaJO,. Реакционную смесь периодически перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. В результате образ:)отся альдегидные группы. ПЦШ отм11шают 500 мл Ц,О на стеклянном фильтре и хранят при 4 С. Количество альдегидных групп практически не снижается по крайней мере в течение двух лет.

300 кг альдегидного производного ШР промывают на стеклянном фильтре 50 мл 0,1 М карбонатно-бикарбонатно- го буфера рН 9,5 и добавляют 1,5-ди- аминонентан в избытке до конечной концентрации 0,02 М в объеме 25 мл. Реакцию проводят в течение I ч при комнатной температуре. В конце реакции непрореагировавшие альдегидные группы, а также Шиффовы основания восстанавливают 100 мл 0,2% NaBH4 в 0,1 М NaHCOg.

300 мг ищи промывают 50 мл 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера рН 10,6 с 0,00 М этилендиаминтетра- уксусной кислоты и добавляют К-а)де- тилтомоцистеинтиолактон в избытке до конечной концентрации 0,015 М в объеме 15 мл. Реакцию проводят 2,5 ч при комнатной температуре. Полученно тиолпроизводное ПЦШ промывают 100 мл 0,1 N три с -НСf буфером рН 8,0 с 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и добавляют 10 мл 0,001 М 5 ,5-дитио-Бъс( 2-нитробензойной кислоты) в избытке в том же буфере. Реакцию проводят в темноте 30 мин при комнатной температуре. Полученное производное ПЦШ отмывают тем же буфером, 0,5 М NaCl, буфером и хранят при 4°С. РаЪ -фрагменты получают из

чистых антител осла нротив IgG кролик а.

II р и М е р 2. Для получения иммуносорбента берут 3 МГ и I мг ГаЪ фрагментов в избытке в 0,1 М rptjc - НС1 буфера рН 8,0 с 0,3 М NaCl и 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и при комнатной температуре пропускают отдельно через две колонки (0,6 X 14 см)5 содержащие по

2 мг конечного продукта ПЦШ. Вьшед- ший белок пропускают через колонки еще Д1за раза. ПЦШ отмывают тем же буфером и определяют количество связавшегося белка. К ПЦШ в колонках Б данных условиях присоединяется 1,2 Ml и 0,57 мг Feib -фрагментов со- отпе ственно.

Емкость и специфичность полученпых иммуносорбентов иллюстрируется следующим примером. . ..

П р и М е р 3. Через колонки с П11Ш, содержащие 1,2 мг и 0,57 мг г а) -фрагментов, пропускают 1 мл и

0.55 u нормальной сыворотки кролика. Колонки )Iвaют 0,5 М NaCl рН 7,0 до исчезновения белка в промывном piLCTBoj e . Присоеди}1ившийся материал элюируют 0,01 NHC1 с 0,5 М

Na.Cl и нейтрализуют добавленргем сухого Na.HCOi . Результаты иммунодиф- фузионного анализа элюированного материала указывают на специфичность синтезированного иммуносорбента.

Количество злюированного антигена ( Гг:0 кролика) с колонок соответственно составляет 2,, 24 мг и 1,5 мг, что соответствует емкости 187 мг/г и 125 мг/г иммуносорбента. Однако молярные cooTHoaieHHH элюированного антигена (ТяО кролика) и РаЪ -фрагментов на иммуносорбентах различают- с.ч (0,69 0,96), т.е. в случае меньшего содержания Fs,b -фрагментов

на ПИШ с

.

ся тем, что больвгее количество Fab па ПЦШ создает более плотное расположение их на ПиШ, что приводит к

стерическим препятствиям для реакции с антигеном.

При использовании ПЦШ с присоединенными цельными молекулами антител емкость составляет 50-60 мг/г

(примерно в три раза меньше чем в примере 3s а соотношение антиген/активный центр антитела гораздо ниже 0,25.

антигеном реагирует каждый центр Fab . Это объясняет