Способ приготовления эритроцитарного диагностикума для иммуноанализа Советский патент 1992 года по МПК G01N33/556 

Изобретение относится к области имму- нобиотехнологии, а именно к инженерной иммунохимии, и может быть использовано в производстве иммунодиагностических тест-систем для определения антигенов и антител.

Известны иммуноэналитические методы, которые основаны на применении сте- реоспецифичных определяемому лиганду афикных реагентов, меченных эритроцитами (реакции непрямой и пассивной гемагглюти- нации - РИГА и РПГА, эритроиммуноадсорб- ция-ЭрИА 1 и 2.

Ковалентная иммобилизация иммунореагентов на эритроцитах позволяет

получать высокоактивные и стабильные эритроцитарные диагностикумы. Наиболее эффективными являются двух- этэпные методы конъюгирования, предполагающие предварительную активацию эритроцитов (I этап) с последующей иммобилизацией на их поверхности интактных антигенов, антител и других им- мунореактивных соединений (II этап). Двухэтапные методы гарантируют сохранность функциональной активности меченых эритроцитами иммунореагентов. Активация может осуществляться путем прямой химической модификации пептид- ных или углеводных групп мембраны зритVI

S

о ю о

роцитов в реакционноспособные группы, либо внедрением экзогенных реактивных групп в процессе обработки эритроцитов гомо- и гетеробифункционэльными реагентами. В известных способах избирательно активируются либо пептидные (чаще первичные аинные). либо углеводные (чаще гидроуксильные) группы мембраны эритроцитов. Соответственно этому антигены и антитела иммобилизируются либо на белковых порциях интегральных и периферических гликопротеинов, либо на полисахэридах гликокаликса активированной поверхности эритроцитов. Поэтому известные способы не позволяют ковалентно связывать специфичные ана- литу иммунореагенты на 100% теоретически функционально активной в отношении химической модификации площади мембраны эритроцитов, т.е. достигать максимально возможной плотности их ковалентной иммобилизации.

Чувствительность иммуноаналитиче- ских методов с эритроцитарными диагно- стикумами прямым образом зависит от плотности иммобилизации специфичных аналиту иммунореагентов на поверхности эритроцитов и является теоретически максимальной при максимальной плотности их иммобилизации.

Наиболее близким к предлагаемому является способ приготовления зритроцитар- ных диагностикумов для иммуноанализа, заключающийся в следующем: 50% взвесь Формалинизированньгх эритроцитов барана обрабатывают 0,001 М мега-периодэтом натрия в 0.02 М ацетатном буфере рН 4,9 при + 4°С в течение 30 мин. Активированные эритроциты отмывают 0.05 М фосфатным буфетом (ФБР) рН 8.5. и используют для конъюгировэния с иммуноглобулином G человека. 1% иммуноглобулин G (10 мг/мл) в ФБР инкубируют с активированными эритроцитами 2 ч при 22°С, после чего добавляют борогидрид натрия до конечной концентрации 0,01% и инкубируют еще 1 ч при + 4°С в темноте. Готовый эритроцитар- ный диагностикум (иммуноглобулин С.ме- ченный эритроцитами) используют (после отмывки забуферными фосфатами (0.15 М растоором хлорида натрия рН 7,2, ЭФР в РПГП для определения ревматоидного фактора 3.

Известный способ основан на прямой химической модификации парных гидро- ксильных групп гексозных и пентозных колец мембранных углеводов эритроцитов за счет их окисления анионами мета-периода- то в реактивные альдегидные группы. Ковэ- лентная связь образуется в виде оснований

Шиффра с участием альдегидных групп активированных полисахаридов эритроцитов и первичных аминогрупп иммобилизуемых IgG с последующей стабилизацией валкиламинные связи восстановлением борогидридом натрия. IgG ковалентно связываются на полисахаридах гликокаликса. но не на белках мембраны активированных эритроцитов. В результате IgG иммобилиэируются с

0 немаксимальной плотностью, так как избирательный характер ковалентного связывания не позволяет конъюгировать их с 100% теоретической площади мембраны эритроцитов.

Недостатком известного способа является низкая чувствительность иммуноанализа с приготовленным диагностикумом, которая является следствием немаксимальной плотности иммобилизации аналит-спе0 цифичного иммунореагента (tgG) на поверхности зритроцитарной метки. Кроме того, при обработке эритроцитов очень низкой концентрацией мета-периодата натрия (0,001 М) происходит неполная активация

5 полисахаридов гликокаликса.

В то же время прототип не допускает увеличения концентрации анионов мета- периодата. так как в более высоких концентрациях он активно окисляет гемовые

0 пигменты, что ведет к обесцвечиванию активируемых эритроцитов (при этом существенно снижается контрастность метки). Целью изобретения является повышение чувствительности иммуноанализа.

5 Поставленная цель достигается путем ковалентной иммобилизации аналит-специ- фичных иммунореагентов на эритроцитах, активированных мета-периодатом натрия в смеси с высокомолекулярным декстраном.

0 При активации, которую проводят в щелочных условиях (рН 9.6) при комнатной температуре (22°С) в течение 20 мин.происходит одновременная модификация как полисахаридов гликокаликса эритроцитов..так и

5 находящихся в растворе молекул декстра- на. Активированный высокомолекулярный декстрэн представляет собой образующийся In situ в процессе активации пол- иьэлентный гомо-полифункциональный

0 реагент (по характеру реактивных групп- попиальдегид). рН активации соотьеютву- гт рН коньюгирования. поэтому молекулы зльдегиддекстрана за время активации ковалентно связываются с аминогруппами

5 интегральных и периферических белков мембраны эритроцитов, экспонируя в раствор большое количество свободных реактивных альдегидных групп.

Таким образом, активированной становится максимум (100%) теоретической площади поверхности эритроцитов. Ковалент- ное связывание активированного декстрана создает выгодные пространственные условия для дальнейшей иммобилизации ли- ганд-специфичных иммунореагентов на некотором удалении от поверхности мембраны эритроцитов (спейсерный эффект), что увеличивает степень свободы их реагирования с определяемыми лигандами. Кроме того, отличие от известного способа состоит в применении в 20 раз большей концентрации мета-периодата натрия (0,002 М, а 0.001 М в известном способе, которая-обеспечи- вает более полную активацию мембранных полисахзридов эритроцитов, при этом не наблюдаеся уменьшение их контрастности. П р и м е р 1. Активация эритроцитов. К 1 мл 50%-ной взвеси формалинизирЪвэн- ных эритроцитов барабана в 0,05 М карбо- натно-бикарбонатном буфере (КББ) рН 9,6. добавляют 3 мл 10%-ного декстрана т-500 о КББ и 1 мл 0.1 М раствора мета-периодата натрия (х.ч.). Смесь инкубируют, интенсивно перемешивая встряхиванием 20 мин при 22°С. Активированные эритроциты отмывают центрифугированием 5 раз в КББ.

Иммобилизация иммунореагентов. 0.5 мл 50%-ной взвеси активированных эритроцитов смешивают с 2 мг специфичного определяемому лиганду иммунореа- гента в 2 мл КББ. Инкубируют 1 ч при 22°С и постоянном перемешивании и затем, после добавления борогидрида натрия (х.ч.), до конечной концентрации 0,02% еще 1 ч при 4°С в темноте.

Взвесь готового эритроцитарного ди- агностикума отмывают в ЭФР с 0,05% твина-20 и хранят в том же растворе с 0.02% азида натрия.

Результаты экспериментального сравнения известного способа представлены в табл.1.

П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но варьируются условия конъюгации: концентрация декстрана, концентрация периодата, время активации, рН.

Чувствительность определения столб- нячного анатоксина в ЭрИА с полученными диагностикумами приведена в табл. 2.

Таким образом, чувствительность имму- ноанализов с эритроцитэрными диагностикумами. приготовленными предлагаемым способом, в 8/16 раз выше чувствительно-, сти, достижимой в известном способе.

Кроме того, способ позволяет в 2 раза сократить время приготовления эрит- роцитарных иммунодиагностикумов - коньюгировэние (иммобилизация иммунореагентов на эритроцитах) длится 1 ч против 2 ч в известном спосегбе. и в 10 раз уменьшить концентрации иммобилизируе- мых иммунореагентов.

Формула изобретения

Способ приготовления эритроцитарного диагностикума для иммуноанализа, включающий обработку формалинизированных эритроцитов периодатом с последующей инкубацией с иммунореагентом и восстановлением боргидридом натрия, о т л и ч э- ю щ и и с я тем, что, с целью повышения

чувствительности иммуноанализэ. обработку периодатом проводят при рН 8.5-9.6 в присутствии 8-12 об.% декстрана с мол.м. 40-500 килодальтон при 20-25°С в течение 10-30 мин, при этом периодат используют в

концентрации 0.01-0,04 М.

Чистые антитела и F (ab)2 - фрагменты чистых антител получены аффинной хроматографией гиперимунных антисывороток лошади на антигенных иммуносорбентах.

Иммуноглобулины G получены из гиперимунной антисыворотки ионнообменной хроматографией на ДЕАЕ - сефадексе А-50.

Определены титры антител в иммунных нефракционированных антисыворотках кролика.

Использован коммерческий реагент аффинно-хроматографического белка А.

Таблица 2

Изобретение относится к области им- мунобиотехнологии. а конкретно к инженерной иммунохимии, и может быть использовано в производстве иммунодиаг- ностических тест-систем для определения антигенов и антител. Целью изобретения является повышение чувствительности имму- ноаналиэа. Поставленную цель достигают путем ковалентной иммобилизации ана- лит-специфичных иммунореагентов на эритроцитах, активированных мета-перио- датом натрия в присутствии высокомолекулярного декстрана. Это позволяет увеличить чувствительность определения антигена и антител в 8-16 раз по сравнению с известными способами. 2 табл. СО