Способ получения сорбента на основе целлюлозы Советский патент 1982 года по МПК C08B15/06 

(Г)) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА НА ОСНОВЕ

1

Изобретение относится к биотехно логии, а именно к способу получения сорбента для специфического связывания антител и антигенов.

Известен способ получения иммуносорбонта на основе суспензии целлюлозы, полученной пёреосаждением из медно-аммиачного раствора. Эти иммуносорбенты благодаря большой общей поверхности частиц обладают высокой емкостью, т.е. способны присоединять большие количества антител (300900 мг на 1 г сорбента ).

Однако их существенным недостатком является невозможность использования в колонках, так как через слой таких иммуносорбентов водные растворы почти не протекают. Целью изобретения является получение высокоемкого препарата, способ- ® ного пропускать ток жидкости. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбен.ЦЕЛЛОЛОЗЫ

та на основе целлюлозы, включающему переосаждёние целлюлозы из ее медноаммиачного раствора с последующими активацией и коньюгацией с белком, 0,5-6, раствор целлюлозы, эмульгированный в смеси бензола и хлороформа при ихсоотношении 1:2,5 в присутствии 0,1-0,4 полиэтиленсорбитанмоноолеата переосаждают введением в раствор серной кислотыв ацетоне.

10

После присоединения белка к таким пористым целлюлозным шарикам был получен иммуносорбент,обладающий и высокой емкостью ,и способностью пропускать ток растворителя.

IS

На чертеже схематично изображено устройство, реализующее предлагаемый способ. Пример 1. Приготовление шариков ,88 г свежеприготовленной Си (ОН )/ растворяют в 5П мл NH40H и добавляют 6,0 г целлюлозного пороика полученного из хлопчатника 3 96 ). Раствор осветляют центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин и используют для приготов ления шариков двумя способами: 1.Получение шариков эмульгированием. 75 мл медноаммиачного раствора целлюлозы помещают в сосуд Л емкостью 0,5 л, куда налито 150 мл смеси хлороЛорм-бензол (1:2,5),содержащей 0,15 мл поверхностно-активного .вещества (полиоксиэтиленсорбитанмонолеат-Тпин-80). В сосуд опускают мешалку и смесь эмульгируют 5 мин при 40 об/мин. После окончания эмульгирования смесь выпускают,через нижний отросток сосуда А непосредственно, в регенерирующий раствор CtOO мл ацетона и мл концентрированной серной ки слоты.), налитый в сосуд Б (см. чертеж). Через 10 мин жидкость, сливают, а образовавшиеся шарики отмы .вают 10 объемами воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции, содержащие части цыразмером 100-280 мк. 2.Получение шариков распылением. 75 мл 6 -ного медно-аммиачного раствора целлюлозы, в который Добавлено 0,075 мл поверхностно-активного вещества (полиэтиленсорбитанмоноолеат-Тпин-80) распыляют через пульвери затор при избыточном давлении 0,25 атмосферы в 200 tv} ацетона, содержащего 10 мл концентрированной серной кислоты и помещенного в 0,5 л колбу с низким горлом. Затем жидкость сливают, а частицы промывают 10 объемами .воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции размером 150-420 мк. Активирование носителя. К 1 г отмытых целлюлозных пористых шариков добавляют 100 мл 0,2 М NaJO. Реакци онную смесь слегка перемешивают 30 мин при комнатной температуре в темноте. Окисленные шарики промывают на воронке Бюхнера 200 мл воды и хра нят в воде. Окисленнь й продукт оста ется активным и может быть использован по крайней мере в течение 6 ме Сочетание с белком. 1 г активированных целлюлозных пористых шариков промывают на воронке Бюхнера 200 мл 0,1 М карбОнат-бикарбонатного буфера (рН 9,0) и добавляют к ним в разных случаях 25,100 или 400 мг белка раст воренного в 10 М этого же буфера. Дл сочетания использовали иммуноглобули 4 G кролика (JgG) , который может являться как антигеном, так и антителом. Смесь оставляют на 16-18 ч при . После окончания сочетания избыток хшдкости удаляют на поронке Бюхнера и препарат промывают 1 объемом 0,85%-ного раствора МаСГ. Затем к осадку для восстановления добавляют 100 1п 0,2 М NaBH4 в 0,85 о-ном растворе NaCB. Восстановление проводят в течение 1 ч при комнатной температуре. Препарат последовательно отмывают +500 мл р,85 -ного раствора NaCI, таО мл 0,01 н. НС содержащей 0, NaC и 200 мл 0, NaCI. Полученный иммуносорбент хранят в 0, растворе NaCI при (°С. При необходимости длительного хранения к нему добавляют мертиолят до концентрации 1:10000. Пример 2. Приготовление шариков. А,88 г свежеприготовленной СиСОН) растворяют в 50 мл ННдОН и добавляют 1,5 г целлюлозного порошка, полученного из линта хлопчатника. Раствор осветляют центри- фугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин и используют для приготовления шариков двумя способами: 1.Получение шариков эмульгированием. 75 Ш медно-аммиачного раствора целлюлозы помещают в сосуд А,емкостью 0,5л, куда налито 150 мл смеси хлороЛорм-бензол (1:2;,5), содержащей 0,6 мл поверхностно-активного вещества (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат - Твин-80). В сосуд опускают мешалку и смесь эмульгируют 3 мин при 190 об/мин. После окончания эмульгирования смесь выпускают через нижний отросток сосуда А непосредственно в регенерирующий ,раствор (ЛОО лл ацетона и 16 мл концентрированной серной кислоты ), налитый в сосуд Б. «Через 10 мин хидкость сливают, и образовавшиеся шарики отмывают 10 объемами воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют фракции, содержащие частицы размером 100-280 мк. 2.Получение шариков распылением. 75 мл медно-аммиамного раствора целлюлозы, в котррый добавлено 0,3 мл поверхностно-активного вещества (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат-Твин-80 ), распыляют через пульверизатор при избыточном давлении 0,25 атмосферы в 200 fvi ацетона, содержащего 8 мл конценрированной серной кислоты и помещенного в колбу на 0,5 л с низким горлом. Затем жидкость над частицами сливают и их промывают 10 объемами воды. Продукт фракционируют путем оседания в цилиндре и отделяют- фракции размером 1бО- 20 мк.

Активирование носителя. К 1 г отмытых целлюлозных пористых шариков добавляют 100 лл 0,2 М МаЗО . Реакционную смесь легко перемешивают 30 мин при комнатной температуре в темноте. Окисленные шарики промывают на воронке Бюхнера 200 мл воды и хранят в воде. Окисленный продукт остается активным и может быть использован по крайней мере в течение 6 мес.

Сочетание с белком. 1 г активированных целлюлозных пористых шариков промывают на воронке Бюхнера 200 мл 0,1 М карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,0 и добавляют к ним в разных случаях 25,100 или tOO мг белка,растворенного в 10 мл этого же буфера. Для сочетания использовали иммуноглобулин d кролика () , который может являться как антигеном, так и антителом. Смесь оставляют на 16-18 ч при . После окончания сочетания избыто жидкости удаляют на воронке Бюхнера М препарат промывают 1 объемом bjBS -Horo раствора NaCt. Затем к осадку для восстановления добавляю Т 100 мл 0,2М ЫаВН4 в 0,85%-ном растворе NaCB. Во.сстановление проводят в течение 1 ч при комнатной температуре. Препарат последовательно отмыва|Ют 500 мл 0,85 -ного раствора NaCt, 100 мл 0,01 н. НС .содержащей 0,,ной NaCt и 200 мл 0, NaCt. Полученный иммуносорбент хранят в 0,8Б%-ном растворе NaCt при k°Z. При необходимости длительного хранения к нему добавляют мертиолят до концентрации 1:10000.

f . ,

Сравнение иммуносорбентов на основе известной суспензии и пористых шариков представлено в табл. 1.

-Таблица

Количество целлюлозы в 100 мл свободно осевших частиц,

Пример 3. Приготовление ша-осветляют центрифугированием в течериков 1,20 г (еприготовленной ние 10 мин при 3000 об/мин-. ПолученСи(ОН)2 растворяют в 150 мл 15%-нойный U-ный раствор целлюлозы исNN4011, добавляют 2 г медицинской хлоп-пользуют для приготовления шакоиой воды (гигроскопичной ). Растворриков.

Получение.шариков эмульгированием. 75 мл медно-аммиачного раствора целлюлозы помеьцают в сосуд А емкостью 0,5 л,куда налито 150 мл смеси хлороформ-бензол (1:2,5), содержащей . $ 0,15 Л поверхностно-активного вещества (полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат Твин-80). В сосуд опускают мешалку и смесь эмульгируют 5 мин при иО об/ . /мин. После окончания эмульгирования to смесь выпускают через нижний отросток сосуда А непосредственно в регенерирующий раствор (400 Мл ацетона и 2 мл концентрированной серной кислоты), на-, литый в сосуд Б. Через 10 мин жид- 15 кость сливают, а образовавшиеся шарики отмывают 10 объемами воды. Продукт фракционируют путем оседания в ци- . линдре и отделяют фракции, содержащие частицы размером 100-280 мк. , . 20

Активирование носителя. К 1 г отмытых целлюлозных пористых шариков добавляют 100 нп 0,2 М Na30. Реакционную смесь слегка перемешивают 30 мин при ко натной температуре в темноте. 2$ Окисленные шарики промывают на воронке Бюхнера 200 мл воды и хранят в воде. Окисленный продукт остается активным и может быть использован по крайней мере в течение 6 мес. зо

Сочетание с белком. 1 г активированных целлюлозных пористых шариков промывают на воронке Бюхнера 200 мл 0,1 М карбонат-бикарбонатного буфера рН 9,0 и добавляют к ним в разных случаях 25,100 или lOO мг белка, раст воренного в 10 мл этого же буфера. . сочетания использовали иммуногло булин у кролика. Смесь оставляют на 16-18 ч при . После окончания сочетания избыток х идкости удаляют на . воронке Бюхнера и препарат промывают 1 объемом 0,85 -ного раствора NaCl. Затем к осадку для восстановления добавляют 100 мл 0,2 М NaBH4 в 0,85а-ном растворе MaCt. Восстановление проводят в течение 1 ч при комнатной температуре. Препарат последовтельно отмывают 500 мл 0,85 -ного раствора NaCt-, 100 tv 0,01 н. НС , содержащей 0,8Г)-ной NaCt и 200 мл 0, NaCf. Полученный иммуносорбент хранят в 0, растворе iNaCt при 4°С. При необходимости длительного хранения к Нему добавляют мертиолят до концентрации 1:10000.

В табл./ 2 и 3 приведена характеристика иммуносорбентов на основе целлюлозных пористых тел.

м

м

о о

ОС

1Г о

-4со со

sD

1Л

(f VO

о

о

иг

0

ГЛ

CNJ

го

г

ч

г

рг

.UA

о

СЭо«

fv-t

o- r--.

ts

0-4

vC CM

r

r (S

r

CvJ

Csl

ил

ил

«s

«I

СЭ

СЭ

vO

,- tM

Характеристика синтезированных иммуносорбентев. В табл. 1 приведены сравнительные данные свойств иммуносорбентов в виде известной суспензии и предлагаемых иммуносорбентов на основе пористых целлюлозных шариков.

Результаты кЬлоночных опытов с иммуносорбентами на основе пористых целлюлозных шариков приведены втабл.2.

Как видно, из приведенных данных, синтезированные иммуносорбенты по емкости не уступают иммуносорбенту на основе суспензии целлюлозы и способы присоединять от 250 до 1000 мг антител на 1 г сорбента. Однако, в отличие от известного , иммуносорбент на основе пористых целлюлозныхшариков способен хорошо пропускать ток жидкости , что делает его пригодным для использования в хронатограЛических колонках.

Использование предлагаемого способа получения иммуносорбента на основе пористых целлюлозных шариков имеет следующие преимущества:

основа для приготовления иммуносорбента готовится из дешевого сырья (целлюлозы );

основа для иммуносорбента может выпускаться в активированном состояНИИ и хранится многими месяцами;

приготовление иммуносорбента на основе хранящихся целлюлозных шариков очень облегчено, т.е. потребителю достаточно добавить необходимый белок

(антиген или антитела и восстановит препарат;

препараты иммуносорбентов обладают большой емкостью и не уступают в этом отношении известному, они могут хорошо пропускать ток жидкости, благодаря чему их можно использовать IP хроматограЛических колонках.

Предлагаемый иммуносорбент может найти широкое применение в /биомедицинской технологии.

Формула изобретения

Способ получения сорбента на основе целлюлозы, включающий переосаждение целлюлозы из ее медно-аммиачного раствора с последующими активацией и коньигацией с,белком, а т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью получения пысокоемкого препарата, способного пропускать ток жидкос- и, 0,5-6,0%ный раствор целлюлозы, эмульгированный в смеси бензола и хлороОорма при их соотношении 1:2|5 в присутствии 0,1-0,% полиэтиленсорбитанмоноолеата, переосаждают введением в раствор серной кислоты в ацетоне. .

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Гурвич А.Е. и др. Биохимия, М,, 1961, с. т. 26, с. 93 (прототип).