Иммуносорбент Советский патент 1981 года по МПК C07G7/00 C12N11/08 G01N33/54 

(54) ИММУНОСОРБЕНТ

Изобретение относится к области получения иммуносорбентов для иммуно логических исследований. Иммуносорбенты достаточно широко применяют в иммунологических и биохимических исследованиях для выделения высокоочищенных препаратов антител антигенный, иммуносорбент или белков антительный сорбент . Для эт го исследуемый белок тем или иным сп собом связывают с полимерным носителем, полагая, что после образования нерастворимого иммунного комплекса на иммуносорбенте появляется возможность максимально полного освобождения препарата от различных примесей. После диссоциации иммунного комплекса антитела (или антигены) освобождаются с иммуносорбента в чистом виде. Отсюда видно, что иммуносорбенты долж ны отвечать ряду требоБаний, i.e., он должны обладать механической прочностью, не разрушаться при многократном использовании, не обладать неспецифической сорбционной способностью и обладать достаточной емкостью, под которой понимают количество белка, иммо-, билизованного на единице веса или объема носителя. Известен иммуносорбент на основе коллагена I типа, представляющий собой коллаген I типа, связанный с диазотированной п-аминобензилцеллюлозой (РАВ-целлюлоза) . Способ получения данного соединения .включает стадии предварительной подготовки носителя, т.е. диазотирование РАВ-целлюлозы смесью соляной кислоты и нитрита натрия и связывание диазотированного носителя с коллагеном Г типа р. Недостатками известного иммуносорбента являются недостаточно высокая емкость (0,06 мг антител/мг коллагена, содержащегося в сорбенте,или O,t)6 мг антител/мг сорбента, или 1 мг коллагена/мл сорбента) , а также недостаточная механическая прочность..Кроме того, структура и свойства иммуно38сорбента обуслаилинает необходимость использования для элюции антител опре деленного элюирующего агента - трипсиновых фрагментов коллагена, получение которых само по себе представляет дополнительную трудоемкую процедуру, в- результате чего усложняется и использование сорбента. Целью изобретения является новый иммуносорбент на основе коллагена I типа, обладающий улучшенными свойства ,ми по сравнению с известным (большей емкостью и механической прочностью) и обуславливающий более простые условия использования в иммунологической 5 практике, а также расширение ассортимента иммуносорбентов на основе коллагена I типа. Цель изобретения достигается свойствами нового иммуносорбента - коллагена I типа, связанного с модифицированным сополимером акриламида - N , N -метилен-бис-акриламида-агарозы, имею щего следующие элементарный состав и характеристики (на сухое вещество),%: С 52,3-54,8 Н 6,5-10,7 N 4,3-4,5 О 32,7-34,2 S 0,002-0,005 Соединение представляет собой белы водонаполненный гель с содержанием во ды от 92% до 96%, слаборастворимо в диамине, не растворимо в воде, спирте ацетоне, уксусной кислоте и эфире. Способ получения этого продукта, используемого в качестве иммуносорбен та, основан на известной реакции связывания белков.с карбонилсодержащими носителями образованием азометиновых связей между аминогруппами белка и карбонильными группами носителя 2. Введение карбонильных групп на поверхность носителя осуществляется обычно обработкой альдегидами, наиболее часто для такой модификации испол зуется глутаровый альдегид. Способ получения предлагаемого соединения осуществляется следующим образом. Сополимер акриламида N, N-метилен- 50 -бис-акриламида-агарозы модифицируют действием глутарового альдегида в фосфатном буфере, рН - 7,6 в течение 14-16 ч. К активированному таким образом носителю- в растворе добавляют 55 коллаген I типа и ведут реакцию связывания белка с носителем при комнатной температуре в течение 14-16 ч или в течение 48 ч при . с последующим восстановлением азомстиновых сиязей и альдегидных групп продукта. Полученный иммобилизованный коллаген J типа проявляет свойства иммуносорбента, обладает высокой емкостью, хорошей регенерационной способностью и удобен при работе на хроматог.рафических колонках из-за хороших механических свойств. В частности, при синтезе иммуносорбента к носителю присоединяется до 90% белка, участвовавшего в реакции иммобилизации, что в 2 раза превьш1ает аналогичный показатель у известного сорбента. Емкость полученного сорбента составляет: 0,17 мг AT (антител) на мг коллагена сорбента, или 0,22 мг АТ/мл сорбента, или 1,3 мг |коллагена/мл сорбента, что в 3-4 раза превышает емкость известного сорбента. Поскольку оба сравниваемых сорбента в единице объема содержат примерно равное количество иммобилизованного коллагена (1,3 мг и 1 мг в 1 мл сорбента), увеличение емкости сорбента можно объяснить Созданием оптимальных условий стерического взаимодействия при образовании иммунного комплекса на иммуносорбенте. Кроме того, элюцию антител на предлагаемом сорбенте ведут обычно употребляемыми агентами - 0,2 М глицин-НС 1 рН - 2,2 без применения трипсиновых фрагментов коллагена. Процесс упрощается и при этом примесь неспецифических белков не увеличивается. Предлагаемый иммуносорбент наряду с повышенной емкостью обладает механической прочностью, химической стаг бильностью и низкой неспецифической сЪрбцией. Отмеченные характеристики обусловлены выбором в качестве носителя гранул1фованного сополимера акриламида N ,М -метилен-бис-акриламида-агарозы, что, наряду с чисто мехаьшческой устойчивостью, создает лучшие условия при образовании на сорбенте иммунного комплекса. Пример. 110 мл сополимера акриламида- Н, М-метилен-бис-акриламида-агарозы марки АсА-44 (размер частиц 60-140,мол.вес. 20000-120000,содержание акриламида 4%, агарозы 4%) многократно отмывают дистиллированной водой до полной прозрачности надосадочной жидкости. суспензию доводят до 6% содержания раствором 25% глутаровогр альдегида на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,6 и оставляют при слабом S8 перемешипаиии на 16 ч при К11миат}юй температуре. После ок(Л1чацця активации избыток глутаропого альдегида уда ляют и гель тщательно отмывают дистил лированной водой до полного отсутствия следов глутарового альдегида. К суспензии затем добавляют раствор кол лагена I типа на 0,1 М фосфатном буфере. рН 7,4 в концентрации 2 мг/мл (всего 195 мг коллагена) и смесь инкубируют при слабом перемешипании в течение 46 ч при 4С, затем несвязавшийся белок отделяют многократным промыванием фосфатным буфером рН 7,4 и 17РОВОДЯТ восстановление сорбента раствором боргидрида натрия на этом же буфере с конечной концентрацией 1 % в течение 45 мин при 4 С. Полученный сорбент отмывают 1 л 0,1 Н фосфатного буфера рН 7,4, 0,5 л 0,2 М глицин-НСЕ рН 2,2 и вновь 1 л 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4. Получают 130 мл геля, 1 мл которого содержит 1,3 мг иммобилизованного коллагена 1 типа (т.е. 90% взятого в реакцию белка иммобилизируется на носителе) . Состав сухого- вещества следу ющий: С 54,8%; Н 6,4%; N 4,6%; О 34,2 S 0,002%, Продукт после добавления мертиолата (1:10000) или азида натрия (до 0,2%) хранят при . Удлинение времени иммо.билизации коллагена I типа нецелесообразно, поскольку при этом усиливаются процессы деструкции молекулы белка. Точно также нецелесообразно увеличение величины рН. П.ример 2. Условия получения соединения идентичны описанным в прим ре 1 за исключением того, что вместо сополимера акриламида-N,N -метилен-бис-акриламида-агарозы марки ЛсА-44, берут марку АсА-22 (содержание.акрилФормула изпйргтеиия

Иммуносорбент, представляющий собой коллаген Г типа, связанный с модифицированным сополимером акриламида-N, N-мeтилeн-бIIC-aкpилaмидn-arapoзы, имеющий следующий элементарный состав (на сухое нещсстно) , л:

С 52,3-54,8

И6,4-10,

Nл -А.

О 32,7-34,2 S 0,002-0,005 Белый водонаполненный гель с содержанием воды от 92 до 96%, слаборастворим в тиамине, не растворим в воде, спирте, ацетоне, уксусной кислоте и эфире.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

anti-collagen antibodies ustng a spe- 2. Иммобшшзрванные ферменты. Под cific Immunoad sorbent tecanique, ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, Z. Immuni tatsforsa, 1967, 134, 4, К. Мартин§ка.. .Т. К, М., 1976, изд-во 391-396.МГУ, с. 184.