АНТИБИОТИК 985 И, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ШТАММ STREPTOMYCES CHROMOPURPUREUS SUBSP. CHIKETAMANUS SUBSP. NOV. 985 - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА 985 И Советский патент 1995 года по МПК C12P1/06 C07D207/32 C12P1/06 C12R1/465 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства антибиотиков.

Целью изобретения является изыскание нового антибиотика, обладающего антибактериальной активностью, в том числе против антибиотикоустойчивых стафилококков, а также изыскание штамма продуцента данного антибиотика.

Антибиотику 985 И соответствует структурная формула

Антибиотик 985 И представляет собой порошок кремового цвета, нерастворимый в воде, растворимый в гексане, петролейном эфире, диэтиловом эфире, этилацетате, хлороформе, ацетоне, диметилсульфоксиде, диметилформамиде, тетрагидрофуране, спиртах, водных растворах щелочей, т.пл. 73-75^oC, [ α_D -374^o (c 1, СHCl₃).

Брутто-формула антибиотика 985 И; С₂₉Н₃₉NO₄ (по данным спектров ЯМР и масс-спектру высокого разрешения), для пика молекулярного иона (М⁺) найдено: м.е. 465, 2916 (расчет 465, 2880).

В масс-спектре наблюдаются следующие осколочные ионы (брутто-состав установлен по масс-спектрам высокого разрешения), характеризующие строение антибиотика 985 И: 436,2480 (С₂₇Н₃₄NO₄)⁺; 371,2536 (С₂₄Н₃₅O₃)⁺; 251,1671 (С₁₅Н₂₃О₃)⁺; 214,1227 (С₁₄N₁₆NO)⁺; 212,1413 (С₁₂Н₂₀O₃)⁺; 94,0284 (С₅H₄NO)⁺. В спектре ¹³С ЯМР в СDCl₃ наблюдается 29 сигналов ядер углерода со следующим отнесением: δ 13,27; 13,48; 13,68 (СН₃); 21,80; 22,08; 26,26; 27,65; 28,79 (СН₂); 30,50; 40,32; 41,42; 44,52; 44,90; 52,16 (СН); 74,44; 74,56 (СН-O); 109,92; 115,84; 124,37; 125,17; 127,08; 128,88; 130,06; 132,11 (СН=C); 132,20; 140,14 (С=C); 179,38; 183,59 (С=0) м.д.

В спектре ПМР в СDCl₃ наблюдаются сигналы протонов трех метильных групп: дублет при δ 1,15 м.д. J 7,1 Гц; 3Н и частично перерывающий дублет при δ 0,83 м.д. J 7,7 Гц; 3Н и триплет при δ 0,78 м.д. J 7,7 Гц, 3 Н. В области δ 1,4-2,2 м.д. регистрируется группа сигналов, соответствующая по интегральной интенсивности 15 Н, двенадцати метиленовым и трем метиновым протонам. Двойной квартет протона СН-СOOН наблюдается при δ 2,93 м.д. J 10,0 и 7,1 Гц, 1Н, а двойной триплет метинового протона -CH₂-CH-O- при δ 3,89 м.д. J 10,0 и 4,0 Гц, 1 Н. Дублетный сигнал при δ 4,19 м.д. J 3,2 Гц, 1Н относится к метиновому фрагменту -C-С-O. Группа сигналов в области δ 3,13-3,6 м.д. с интегральной интенсивностью 2 Н относится к метиновым протонам фрагментаCН--CН-= O. В области спектра δ 5,2-6,1 м.д. регистрируются сигналы протонов винильных фрагментов интегральной интенсивности 5 Н. Мультиплетные сигналы протонов пиррольного фрагмента наблюдаются при δ 6,94 м.д. 2 Н/-=CH-NH и δ 6,23 м. д. 1 Н/CН-CH=CH-NH. В слабом спектре регистрируются два широких сигнала, относящихся к протонам карбоксильной и аминогруппы при δ 8,5 и 10,2 м.д. соответственно.

В УФ-спектре в метаноле наблюдаются максимумы поглощения при 245 нм ( ε 32000) и 291 нм ( ε 16000), указывающие на наличие сопряженной двойной связи и пиррольно-карбонильного хромофора соответственно.

В ИК-спектре в KBr-диске наблюдаются максимумы поглощения при 1630 (С= C), 1650 (С=C-C=O), 1710 (СOOH) cм^-1.

Анализ спектральных данных позволил отнести антибиотик 985 И к группе пирролэфиров, содержащих карбоксильную группу. Антибактериальный спектр антибиотика 985 И представлен в табл.1.

Для получения антибиотика используют штамм Str. chromopurpureus subsp. chiketamanus subsp. nov. 985.

Штамм 985 выделен из почвенного образца Горно-Алтайской авт.обл. Депонирован во ВНИИА под номером N 1702.

Культурально-морфологические признаки. Образует обильный воздушный мицелий розово-лилового цвета, спороносцы прямые, споры с гладкой поверхностью размером 0,6-0,7 ˙1,1-1,2 мкм. Субстратный мицелий сливяно-серо-фиолетовый, буро-коричневый-фиолетовый до каштанового и темно-вишнево-красного. В среду выделяется пигмент буро-коричневый-каштановый с фиолетовым оттенком до вишневого и пурпурного.

Культурально-морфологические признаки Streptomyces sp. штамм 985 И-продуцента антибиотика 985 И представлены в табл.2.

Физиолого-биохимические признаки. Aэроб, оптимум роста 26-28^oC. Желатину разжижает, молоко пептонизирует и коагулирует, крахмал гидролизует. Меланоиды не образует (среда Теснера с лимоннокислым железом, агар с тирозином). Потребление различных источников углерода (среда Придгейма-Роттлиба): хорошо растет в присутствии α -ксилозы, α -раффинозы, l -рамнозы, d-мальтозы, d-маннита, d-лактозы, i-инозита; умеренно в присутствии dl-сахарозы, d-глюкозы, d-галактозы; слабо в присутствии l-арабинозы, d-фруктозы, не растет в присутствии d-сорбита.

Рост на клетчатке умеренный.

Антибиотик 985 И получают культивированием Streptomycеs chromopurpureus subsp. chiketamanus subsp. nov. штамм 985 на средах, содержащих в качестве источника углерода глюкозу, крахмал, сахарозу, глицерин, в качестве источника азота соевую муку, гороховую муку, кукурузный экстракт, дрожжевой гидролизат и минеральные соли: NaNO₃, (NH₄)₂SO₄, NaCl, СoCl₂, СаСO₃.

Культивирование проводят в условиях аэрирования при перемешивании при 28-30^oC в течение 96-144 ч. Антибиотик накапливается в культуральной жидкости и в мицелии. Содержание антибиотика определяется титрованием методом диффузии в агар в отношении Bac. subtilis АТСС 6633. Количество антибиотика в 1 л культуральной жидкости составляет 100-120 мг.

Антибиотик экстрагируют из мицелия органическим растворителем (предпочтительным является ацетон), из нативного раствора органическим растворителем, не смешивающимся с водой (предпочтительным является бензол).

П р и м е р. Для получения спорового материала культуру Streptomyces chromopurpureus subsp. сhiketamanus subsp. nov. штамм 985 выращивают в течение 7-10 дней при 28^оС на овсяном агаре следующего состава, Овсяные хлопья 5,0 Агар-агар 2,0 рН до стерилизации Естественный
Для получения вегетативного посевного мицелия споры культуры засевают в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащие 150 мл питательной среды следующего состава, Сахароза 2,0 Крахмал 0,85 Гороховая мука 1,5 NaNO₃ 0,5 СаСО₃ 0,5 СoCl₂ 0,000008
Посевной мицелий выращивают в течение 40-48 ч при 28-30^oC в колбах на качалках (240 об/мин). Выращенный мицелий в количестве 5 об. вносят в колбы с ферментационной средой (состав аналогичен составу посевной среды) и проводят ферментацию антибиотика на качалке (240 об/мин) в течение 120 ч при 28^oC.

От 1000 мл культуральной жидкости отделяют центрифугированием мицелий (100 г). Из мицелия антибиотик извлекают двухкратной экстракцией ацетоном (300 и 200 мл). Экстракт упаривают в вакууме до 80 мл водного остатка, из которого антибиотик выделяют двухкратной экстракцией бензолом (по 40 мл бензола).

Из нативного раствора антибиотик экстрагируют бензолом (два раза по 300 мл). Бензольные экстракты объединяют и упаривают в вакууме.

Получают 500 мг суммарного препарата, который растворяют в 5 мл системы растворителей бензол хлороформ метанол 10:10:1 и вносят в колонку с Silpearl/Kavalier, (ЧССР, h 30 cм, d 2,5 см). Элюируют антибиотик этой же системой растворителей. Анализ фракций проводят с помощью ТСХ на пластинках Silufol/Kavalier (ЧССР) в системе растворителей бензол хлороформ метанол 4: 10: 1. Антибиотик обнаруживают биоавтографически, используя в качестве тест-культуры Bac. subtilis AТСС 6633, по поглощению в УФ-свете, проявлением 1% -ным раствором перманганата калия (коричневое окрашивание). Фракции, содержащие антибиотик, объединяют, растворитель удаляют в вакууме и подвергают повторной очистке на колонке с "Silpearl", используя для растворения вещества, элюции и анализа фракции методом ТСХ на пластинках "Silufol" смесь растворителей бензол ацетон 10:1. Фракции, содержащие антибиотик, объединяют, растворитель удаляют в вакууме и получают 100 мг антибиотика 985 И.

1. Антибиотик 985 И формулы

обладающий антибактериальной активностью. 2. Штамм Steptomyces chromopurpureus subsp. chiketamanus subsp. nov. 985, N 1702 (коллекция культур микроорганизмов ВНИИА) продуцент антибиотика 985 И.