ШТАММ Nonomuraea roseoviolacea subsp. carminata (Actinomadura carminata) - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА КАРМИНОМИЦИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРМИНОМИЦИНА Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 C12R1/03 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента противоопухолевого антибиотика карминомицина, применяемого в терапии сарком мягких тканей, лимфосаркомах, ретикулосаркомах, хорионэпителиомах, острых миелобластомах и лимфобластомах, хронических миелоидных лейкемиях, и способа получения антибиотика. Карминомицин - антибиотик «скорой помощи», вызывающий быстрый терапевтический эффект при пероральном, парентеральном и внутривенном использовании. По сравнению с близкими ему по действию и химическому строению противоопухолевыми антибиотиками доксорубицином и даунорубицином обладает наименьшей кардиотоксичностью.

Известен штамм Actinomadura carminata - продуцент антибиотика карминомицина [1]. Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости (не более 70 мкг/мл).

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент карминомицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия нитрозометилбиуретка, метилнитрозогуанидина и гамма-лучей ⁶⁰Со на исходный штамм № ВКПМ S-806 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и даунорубицин в качестве селективных агентов.

Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКМП-81081.

Штамм ВКМП-81081 обладает повышенной продуктивностью карминомицина (120 мкг в 1 мл культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ВКМП-S1081. Температура 28°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культуры штамма, выращенного на овсяном агаре. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (таблица 1):

Морфологические признаки. Цепочки спор образуются моноподиально на воздушном мицелии на спиральных или вытянутых спороносцах; цепочки закручены или сжаты, споры округлые или продолговатые, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С, желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимоннокислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует глюкозу; умеренно использует арабинозу, инозит, рамнозу, сахарозу, манит; слабо использует рафинозу; не использует ксилозу, фруктозу.

Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозонитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий. Слабо действует на Escherichia coli. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.

Штамм ВКПМ-S1082 поясняется следующим примером.

Пример. Для получения спорового материала культуру Nonomuraea roseoviolacea subsp carminata (Actmomadura carminata) ВКПМ-81081 выращивают в течение (7-10) суток при 37°С на овсяном агаре следующего состава, %:

Овсяная мука 2,0 Агар 2,0 Вода Водопроводная рН до стерилизации 7,0-7,2

Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении в 1,0 атм. и 120°С.

Для получения посевного мицелия споры культуры засевают на среду следующего состава, %:

Глицерин 0,2 Кукурузный экстракт 0,2 Аммоний хлористый 0,2 Кальция карбонат 0,2 Натрий хлористый 0,2 Вода Водопроводная рН до стерилизации 7,2-7,4

Посевной материал выращивают при 37°С в течение 72 час в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, количество среды в колбах 150 мл. Скорость вращения качалки (200-240) об/мин. Количество посевного материала для инокуляции - 10%.

Ферментация проводится на качалке при 28°С на среде (50 мл в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл) следующего состава, %:

Соевая мука 1.5 Глюкоза 2.25 Крахмал 1.5 (NH₄)SO₄ 0.3 СаСО₃ 0.3 Вода Водопроводная рН до стерилизации 6.4-6.6

Антибиотическая активность, определенная через 146-168 ч ферментации, составляет 120 мкг/мл.

Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является более чем на 70,0% повышенная продуктивность, а именно содержание карминомицина в культуральной жидкости штамма-прототипа 70 мкг/мл, а в заявленном штамме 120 мкг/мл.

Карминомицин выделяют из культуральной жидкости, полученной в результате биосинтеза штамма-продуцента ВКПМ-81081, обработкой ацетоном (1/20 объема) и щавелевой кислотой (до рН 1,0-1,5) при (45-50)°С в течение 1 ч с последующей экстракцией карминомицина фосфатно-цитратным буфером с рН 5,0. Полученный таким образом раствор антибиотика подщелачивают 10%-ным раствором NaOH до рН 8,0, карминомицин повторно экстрагируют хлороформом или хлористым метиленом, экстракт концентрируют в вакууме и антибиотик пропускают через сорбент ПТФЭ, концентрируют в вакууме, растворяют в хлористом метилене и осаждают петролейным эфиром или гексаном.

Карминомицин, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Nonomuraea roseoviolacea subsp carminata (Actinomadura carminata) ВКПМ-S1081, представляет собой кристаллический порошок красно-бурого цвета, легко растворимый в хлороформе, метаноле, растворимый в ацетоне и этаноле и нерастворимый в воде. По физико-химическим свойствам антибактериальной активности и токсичности полностью соответствует требованиям ФС. Брутто-формула: С₂₆Н₂₇NO₁₀. Мол. масса = 513,5 а.е.м.

UV-VIS-спектр: λ_max(этанол) нм: 235, 255, 456, 478, 492, 512, 524.

Мол. масса основания (метод MALDI-MS-TOF)=514 (МН)⁺.

ЛИТЕРАТУРА

1. Авторское свидетельство СССР SU №1476899 от 1989 г. с приоритетом от 10.07.1987 г.

Таблица 1. Культурально-морфологические признаки штамма Nonomuraea roseoviolacea subsp carminata (Actinomadura carminata) ВКПМ-S1081 Агаровая среда Рост воздушного мицелия* Цвет мицелия Растворимый пигмент Воздушного Субстрактного №1 Гаузе Скудный Беловатый (д 1) Бесцветный Нет Овсяная Умеренный Розоватый (р 2) Красновато-лиловый (Н2-Д6) Нет Чапека Скудный     Нет Глюкозо-аспарагиновая Скудный Розоватый (р 2) Буровато-красный (б 4) Лиловый (Н6) Линденбайна (глицерин-нитратная) Скудный Беловатый (д 1) От бурого (б 4) до сливяного(с 10) Нет Глюкозо-нитратная
№2 Гаузе Скудный Розоватый (р 2) От бурого (о 1) до буро-фиолетового (с 1) Буроватый (64) Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом) Меланоидные пигменты не образует */+++ - хороший; ++ - умеренный; + - слабый.

Штамм Nonomuraea roseoviolacea subsp carminata (Actinomadura carminata) BKIIM-S1081 получен в результате многоступенчатого мутагенного воздействия нитрозометилбиуретка, метилнитрозогуанидина и гамма-лучей ⁶⁰Co на исходный штамм № ВКПМ S-806 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и даунорубицин в качестве селективных агентов, и депонирован под номером ВКПМ S-1081. Карминомицин получают путем биосинтеза штамма-продуцента, обработки культуральной жидкости ацетоном и щавелевой кислотой, подщелачивания раствора, экстракции антибиотика хлороформом, реэкстракции антибиотика водным буфером при рН 5,0, повторной экстракцией органическими растворителями при рН 8,0, концентрацией экстракта, фильтрацией через нейтральный сорбент ПТФЭ и выделением антибиотика путем осаждения из раствора в хлористом метилене гексаном или петролейным эфиром в виде основания. Изобретение позволяет повысить продуктивность антибиотика карминомицина, эффективного в терапии сарком мягких тканей, лимфосарком, ретикулосарком, хорионэпителиом, острых миелоблатом и лимфобластом, хронических миелоидных лейкемий (120 мкг в 1 мл культуральной жидкости). 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Штамм Nonomuraea roseoviolacea subsp. carminata (Actinomadura carminata) ВКПМ-81081 - продуцент антибиотика карминомицина.

2. Способ получения антибиотика карминомицина путем биосинтеза штамма-продуцента по п.1, обработки культуральной жидкости ацетоном и щавелевой кислотой, подщелачивания раствора, экстракции антибиотика хлороформом, реэкстракции антибиотика водным буфером при рН 5,0, повторной экстракции органическими растворителями при рН 8,0 с последующей концентрацией экстракта, очисткой на сорбенте ПТФЭ и выделением антибиотика путем осаждения из раствора в хлористом метилене гексаном или петролейным эфиром в виде основания.