ШТАММ AMYCOLATOPSIS FRUCTIFERI SUBSP. RISTOMYCINI - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА РИСТОМИЦИНА Российский патент 2010 года по МПК C12P1/06 C07K14/355 C12R1/365 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма - продуцента антибактериального антибиотика ристомицина из группы полициклических гликопептидов (далбагептидов).

Структура антибиотика ристомицина

Благодаря уникальной способности подавлять биосинтез пептидогликана клеточной стенки антибиотики этой группы эффективны в отношении многих патогенных грамположительных бактерий. Подобно ванкомицину и тейкопланину, ристомицин обладает мощным бактерицидным действием на стафилококков, энтерококков и пневмококков, в том числе метициллинустойчивых и некоторых анаэробов, вызывающих тяжелые септические заболевания. Ристомицин используется в качестве диагностикума при некоторых заболеваниях кроветворения, а также входит в состав ветеринарных препаратов.

Известен штамм Proactinomyces fructiferi var. ristomycini 5339 - продуцент антибиотика ристомицина [1], принятый в качестве прототипа. Недостатком известного штамма является низкий уровень содержания антибиотика в культуральной жидкости (не более 400 мг ристомицина на 1 л культуральной жидкости).

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм - продуцент ристомицина - в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина, ультрафиолетовых и гамма-лучей ⁶⁰Со на исходный штамм с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и ванкомицин в качестве селективных агентов.

Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур «ГосНИИгенетика» под номером штамм ВКПМ-S1085.

Штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 обладает повышенной продуктивностью ристомицина (2,0 г в 1 л культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические признаки штамма ВКПМ-S1085

Температура 37°С; длительность выращивания - (7-12) суток. Посев на агаровые среды споровым материалом с (8-10)-дневной культуры, выращенной на гороховом агаре. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (таблица 1).

Морфологические признаки. Спороносцы прямые, споры продолговатые, поверхность спор гладкая. Гифы вегетативного мицелия септированы. Распадаются на фрагменты (2-3 мкм длины).

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб растет при (24-37)°С; оптимум роста 37°С, биосинтеза 28°С. Желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал не гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с лимоннокислым железом.

Использование источников углерода. Хорошо утилизирует глюкозу, глицерин, арабинозу, мальтозу; умеренно - сахарозу, крахмал, маннит, лактозу; слабо - рамнозу, не использует ксилозу.

Антагонистические свойства

При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus, не действует на Escherichia coli и дрожжи Candida albicans. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.

Штамм-продуцент ристомицина поясняется следующим примером.

Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085, выращенной в течение (7-10) суток при 37°С на гороховом агаре, засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) и выращивают при 28°С в течение (18-24) ч на качалке при (220-240) об/мин.

Состав посевной среды, %:

Глюкоза 1,0 Пептон 0,5 Бульон Хоттингера 3,0 Натрий хлористый 0,5 Вода Водопроводная рН до стерилизации 6,8-7,0

Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,6 атм при 120°С.

Выросшим мицелием в количестве (3-5) % от объема среды засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) следующего состава, %:

Глицерин 2,0 Соевая мука 0,5   Натрий хлористый 0,3 Мел 0,5 Вода Водопроводная рН до стерилизации 6,8

Ферментацию проводят при 28°С в течение (120-144) ч на качалке при (220-240) об/мин. Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis ATCC 6633. Содержание ристомицина в культуральной жидкости к концу ферментации составляет 2000 мкг/мл.

Препарат, полученный на основе нового штамма-продуцента путем сорбции на ионно-обменных смолах и многоступенчатой химической очистки [2], по своим физико-химическим показателям, антибактериальной активности и токсичности полностью соответствует стандартному образцу ристомицина.

Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является способность к биосинтезу с высокой продуктивностью гликопептидного антибиотика ристомицина.

Таким образом, создан новый мутантный штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini BKПM-S1085, отличающийся от прототипа по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения иточников углерода (рамноза, сахароза, крахмал, манноза), по способности образования пигмента и антибиотической активности, которая в 5 раз превосходит активность штамма-прототипа и составляет 2000 мкг/мл (Таблицы №№2 и 3).

ЛИТЕРАТУРА

1. Гаврилина Г.В., Рохленко С.Г. Образование ристомицина на синтетических средах. В сб. «Ристомицин и его применение в клинике», Изд-во «Медицина», Москва, 1965, с.7-13.

2. Бражникова М.Г., Ломакина Н.Н., Лаврова М.Ф., Юрина М.С. и Клюева Л.М. Выделение и свойства ристомицина // Антибиотики, №5, с.392 (1963).

Таблица 1 Культурально-морфологические признаки штамма Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 Агаровая среда Рост воздушного мицелия* Цвет мицелия Растворимый пигмент Воздушного Субстратного №1 Гаузе +- Желтовато-белый, Соо6а, скудный Буроватый (Д-3) Нет Овсяная + Белый (Д-3) до светло-кремового (б6) Бесцветный Нет Чапека + Белый (Д-3) Светло-бурый (Д-4) - Глюкозо-аспарагиновая + Белый (Д-3) Желтоватый (Соо4в) - Линденбайна (глицерин-нитратная) +++ Белый (Д-3) до светло-песочного (Соо6а) Светло-бурый (Д-4)   Глюкозо-нитратная
№2 Гаузе ++ Белый (Д-3) Желтоватый (Соо4в) - Треснера (с пептоном и лимоннокислым железом) +- Белый (Д-3) Бесцветный Нет */++ - умеренный; + - слабый.

Таблица 2 Сравнительные культурально-морфологические свойства нового штамма Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini BKПM-S1085 и штамма-прототипа 5339 Агаровая среда Рост, мицелий и пигмент Новый штамм Штамм-прототип №1 Гаузе Скудный, субстратный мицелий буроватый б3 Умеренный, субстратный мицелий красноватый б1 №2 Гаузе Скудный, субстратный мицелий белый Д3 Умеренный, субстратный мицелий буроватый б3, растворимый пигмент Чапека с сахарозой Хороший, воздушный мицелий белый Д3 до песочного Соо6а Умеренный, воздушный мицелий розоватый 4б, субстратный мицелий оранжево-коричневый в1, пигмент сиреневого цвета

Таблица 3 Сравнительные культурально-морфологические свойства нового штамма Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 и штамма-прототипа 5339 Агаровая среда Рост, мицелий и пигмент   Новый штамм Штамм-прототип Усвоение источников     углерода:     Сахароза Умеренно Хорошо Крахмал Умеренно Хорошо Рамноза Слабо Не утилизует Маннит Хорошо Слабо Водорастворимый пигмент Нет Образует Антибиотическая активность, 2000 400 мкг/мл     Диапазон изменчивости 1000-3000 200-600 активности, мкг/мл    

Заявитель-патентообладатель:

ГУ научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе Российской академии медицинских наук (ГУ НИИНА им. Г.Ф.Гаузе РАМН)

Штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini 8765 получен в результате мутантного преобразования свойств штамма Proactinomyces fructiferi var. ristomycini 5339 в результате последовательного трехступенчатого воздействия метилнитрозогуанидина, ультрафиолетовых и гамма-лучей ⁶⁰Со на исходный штамм и отбора оригинального мутантного штамма с повышенной антибиотической активностью. Полученный штамм отличается от известного по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения источников углерода (сахароза, крахмал, рамноза, манноза) и по способности образования пигмента и антибиотической активности, которая в 5 раз превосходит активность штамма Proactinomyces fructiferi var. ristomycini 5339 и составляет 2000 мкг/мл. Штамм депонирован в ВКПМ под коллекционным номером ВКПМ - S1085. Изобретение может быть использовано в медицинской промышленности при производстве антибактериального антибиотика ристомицина, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми и некоторыми анаэробами. 3 табл.

Штамм Amycolatopsis fructiferi subsp. ristomycini ВКПМ-S1085 - продуцент антибиотика ристомицина.