Способ получения антибиотика 6270 Советский патент 1988 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/01 

(21)3892105/28-13

(22)12,04.85

(31)72912/1984

(32)13.04.84

(33)JP

(46) 07.07.88. Бюл. № 25

(71)Какен Фармасьютикал Ко. Лтд (JP)

(72)Йоко Касукабе, Нобуко Такахаси, Акио Сейно и Ясуо Ивагайа (JP)

(53)615.779.9(088.8)

(56) Патент СССР № 673184, кл. С 12 Р 1/02, 1979.

Заявка Франции № 2164792, кл. А 61 К 21/00, 1973.

(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА 6270

(57) Изобретение относится к новому антибиотику 6270, к способу его получения и применения в качестве анти- кокщадиозного средства или в качестве пищевой добавки для ускорения роста домашних животных и птицы. 11елью изобретения является выделение микроорганизмов, обладающих антибиотическими свойствами. Способ заключается в культивировании штамма Nocatdiopsis sp.FERM ВР-717 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота И минеральные соли при температуре 30°С в течение 96 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 4 табл.

S

о

со

4

о со

со

C/J

Изобретение относится к новому аятибнотику 6270, к способу его получения и применения в качестве анти кокцидиозного средства или в качестве пищевой добавки для ускорения рос та домаиших животных и птицы.

Целью изобретения является выделение микроорганизмов, обладающих антибиотическими свойствами.

Штамм Nocardiopsis sp. 6270 депонирован в Исследовательском ферментационном институте Японии под номером FERM ВР-717..

Морфологические характеристики.

Субстратный мицелий хорошо развит и разветвлен, поэтому ширина каждого мицелия составляет примерно 0,4 мкм. Воздуш ый мицелий хорошо растет в некоторых культуральных средах, таки как сахарозо-нитратная агаровая куль туральная среда (Дифко. Агаровый раствор Чапека), крахмальная агаровая культуральная среда (Т S Р-4, Дифко-Неорганический солевой крах- мальный агар), культуральная среда овсяная мука - агар (I S Р-8) или глюкозо-аспарагиновая агаровая культуральная среда. Воздушный мицелий является прямым или искривленным и внешний вид колонии паутинистый (в целом они образуют паутину). При созревании воздушный мицелий имеет ширину от 0,4 до 0,6 мкм. У стареющей колонии через 10 дней после начала культивирования воздушный мицелий повергается фрагментации и образует длинные споровые цепи, каждая из которых содержит по крайней мере ГО спор. Споровые цепи не являются спиральными. Поверхность спор гладкая, споры имеют цилиндрическую форму. Их размер составляет примерно 0,4-1,2 мкм. Нет спорангия, наблюдаются склероции или синнемы.

Культуральные характеристики.

Тесты проводят в соответствии с общепринятым методом испытаний.

Цвет определяют под стандартным источником освещения ксеноновой лампой.

Приведенные ниже данные относят к условиям роста при культивировании в течение трех недель при 28 С на

агаровой пластинчатой культуральнои среде. Показатель а указывает рост, показатель Ь указьшает состояние воздушного мицелия, показатель с указывает растворимый пигмент и показа0

о 5 Q

0

5

0

5

тель d - наличие других характеристик.

Сахарозо-нитратная культуральная среда (Агаровый раствор Дифко-Чапека):

а) хороший, сероватый,(2 ва);

h) белый, порошкообразный;

с) нет.

Глюкозо-аспарагиновая культуральная среда:

a)хороший, светло-желтый (3ic) до бежевого (3ge);

b)сероватый (Зва);

c)нет.

Глицерино-аспарагиновая культуральная среда:

a)слабый, (2ва);

b)слабое образование;

c)нет. Крахмало-агаровая культуральная

среда:

a)отличный, 3 ic до Shale (Зса);

b)белый порошкообразный;

c)нет;

d)гидролиз крахмала: отрицательно.

Тирозно-агаровая культуральная среда.

a)слабый (3ge)

b)нет;

c)нет.

Питательная агаровая среда (Дифко, Бакто-питательный агар):

a)слабый, светлая пшеница (2еа)

b)нет;

c)нет.

Дрожже-солодовый экстракт агаровая культуральная среда:

a)отличный, трещины (cracks) топаз (Зпе);

b)белый;

c)нет. I

Культуральная среда с овсяной мукой:

a)хороший, оболочка (shell) (2са);

b)2 Ьа;

c)нет.

Физиологи 1еские характеристики.

Интервал температуры роста. Не наблюдают рост ниже 5 или вьш1е 39,5°С. Оптимальная температура 27-38 с.

Разжижение столбика глюкозо-пепто- но-желатиновой культуры: положительно .

Гидролиз крахмала: отрицательно.

Коагуляция и пептонизация снятого молока: нет коагуляции и существенной пептонизации (37 с).

3

Образование меланина: ISP - тиро- эиновая агаровая культуральная среда отрицательно; ISP - тирозиновая культуральная среда с бульоном дрожжевог экстракта: отрицательно; TSP - пеп- тоно-дрожже-железистая агаровая культуральная среда: отрицательно.

Толерантность NaCl: нет роста при А% и вьпие.

Растворимость ксантина, гипоксан- тина, аденина: отрицательно.

Использование источника углерода (баэальная среда Прайдхэма и Готтли- ба).

Положительно: D-глюкоза, L-араби- ноза, D-ксилоза, салицин.

Слабо положительно: D-фруктоза, сахароза.

Отрицательно: инозит, L-рамноза, раффино 3 а, D-ман нит.

Штамм 6270 идентифицируют как штамм, принадлежащий к Nocardiopsis Мейер 1976 среди октиномицетов, так как наряду с упомянутыми различными характеристиками он образует длинные цепи спор в воздушном мицелии, а гид ролизат целых клеток содержит мезо- диаминопимеровую кислоту и галактозу но не содержит арабинозы и мадурозы, кроме того не определяется миколевая кислота.

При осуществлении способа микроорганизм, продуцирующий антибиотик 6270, культивируют в соответствии с традиционными методиками культивиро- вания известных актиномицетов. Однако с промьшшенной точки зрения выгодно применять метод культивирования с аэрацией - перемешиванием. В качестве культуральной среды для продуцирования могут быть применены материалы, обычно используемые для культивирования актиномицетов. А именно могут быть использованы в подходящих сочетаниях различные источники углерода, источники азота и органические и неорганические соли, а также противовспенивающий агент при необходимости. Температура культивиро

вания обычно лежит в интервале от 25 до 35 С, предпочтительно около 30 С. Время культивирования может меняться в зависимости от различных условий. Однако обычно накопление продуцированного антибиотика 6270 достигает максимума через 72-148 ч.

Антибиотик 6270 может быть выделен из культуральной среды и очищен

0

5

0

09

5

5

0

5

0

5

1324

при использовании его физико-химических свойств с помощью традиционных методик, таких как метод использования различия в растворимости примесей, метод использования различий в адсорбции ионообменными смолами или различными адсорбирующими агентами, метод экстракции органическим растворителем, не смещивающимся с водой, или же сочетание различных средств, таких как осаждение, удаление примесей, диализ, сушка и перекристаллизация .

Например, антибиотик 6270, полученный в культуральной среде, извлекают следующим образом. После добавления фильтрующей добавки, такой как диатомитовая земля или Радиолит 700, культуральный бульон фильтруют и фильтрат и микробные клетки соответственно экстрагируют подходящими растворителями, такими как этилаце- тат и ацетон. Затем объединяют клеточный экстракт и экстракт из фильтрата. Отгоняют растворитель из этого экстракта, в результате получают антибиотик 6270 в виде сырых кристаллов, сырые кристаллы подвергают, например, хроматографии. Элюат концентрируют при пониженном давлении, а остаток растворяют в подходящем растворителе, таком как этилацетат, а затем обрабатывают разбавленной соляной кислотой. Слой растворителя концентрируют, в результате антибиотик 6270 кристаллизуется в виде свободной кислоты.

Для получения натриевой соли упомянутый слой растворителя обрабатывают разбавленным раствором соляной кислоты, а затем разбавленньп раствором -карбоната натрия, слой растворителя концентрируют, в результате получают антибиотик 6270 в виде натриевой соли. Полученный таким образом антибиотик 6270 в- виде свободной кислоты или натриевой соли может быть перекристаллизован из подходящего растворителя, такого как н-гексан- этилацетат, чтобы получить чистые кристаллы. Антибиотик 6270 в виде свободной кислоты обладает следуюци-- ми свойствами.

Бесцветные иглоподобные кристаллы, кислотное вещество.

Точка плавления: II5-118°С.

Элементньй анализ найдено,%: С 62.72; Н 9,А9; О 27,78.

f

Удельное вращение: (с) . П,5 (С 1,0, метанол).

УФ-спектр поглоп1е11ия .

Не наблюдается максимумов полос поглощения при 210 нм или более при измерении метанольного раствора.

Характеристические полосы поглощения () в ИК-спектре (таблетка с бромистым калием): 3470, 2980, 2945, 2890, 1735, 1460, 1380, 1315, 1165, 1102, 1075, 987, 980.

Растворимость: растворим в метаноле, этаноле, этилацетате, хлороформе эфире, ацетоне и бензоле; нерастворим и воде.

Цветные реакции, положительно в реакции с ванилином - серной кислотой и в реакции Драгендорфа; отрицательно в реакции с нингидрином; окраска с Ij газообразным.

Тонкослойная хроматография: (на

2 г4

кизельгуре GF , производимом фирмой Мерк Ко):

Система растворителей Величина R Хлороформ:метанол(20:1) 0,49. н-Гексан-этилацетат(1:1) 0,08 Бензол-этилацетат (1:1) 0,04 Хлороформ-ацетон (2:1) 0,36 н-Гексан-зтилацетат (1:3) 0,13 Этилацетат0,22

Н-5ГМР-спектр: наличие трех ме- токсигрупп наблюдается при сГ ппм 3,39 (ЗН), 3,49 (6Н), спектр снят при 100 МГц в тяжелом хлороформе с испо/тьзованием ТМС в качестве внутреннего стандарта.

С-ЯМР-спектр: результаты измерений при 25 МГц в тяжелом хлороформе с использованием ТМС в качестве внутреннего стандарта. Согласно этим результатам общее число атомов углерода равно 44.

Антибактериальный спектр приведен в табл.1. Антибиотик 6270 обладает особенно сильными антибактериальными свойствами против грамположи- тельных бактерий и является полезным как антибактериальный агент.

В низких концентрациях он обладает антикокцидиозной, акарицидной и противовирусной активностями и является полезным как антикокцидиозное средство для домашней птицы, такой как куры, перепела, утки, гуси и индейки, и для домашних животных, таких как коровы, , кролики, буйволы, козы и овцы, в качестве агента для лечения диарреи домашних живот

,

ш,1Х или в качестве агента для увели-, чения эффективности питания или для ускорения роста домашних животных и птицы.

I

Пример 1. Засевают 1 л куль- туральной среды (рН 6,0), содержащей 6,0% глюкозы, 2,0% соевой муки, 1,0%

10 torula дрожжей и 0,5% карбоната кальция, штаммом Nocardiopsis sp. 6270 (FERM ВР-717) и культивируют при З0 с 48 ч. Этим культуральным бульоном засевают 100 л культуральной среды,

15 имеющей указанный состав, и культивируют при 30°С в течение 96 ч при перемешивании в аэрации в сосуде,имеющем емкость 200 л. Скорость аэрачии составляет 100 л/мин, а скорость вра20 щения мещалки равна 250 об/мин. После добавления фильтрующей добавки (Радиолит 700) этот культуральный бульон фильтруют для разведения фильтрата и клеток. Затем фильтрат экс 25 трагируют 40 л этилацетата, а клетки экстрагируют 30 л ацетона. Ацето- .новый клеточный экстракт концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетона и экстрагируют 20 л этил30 ацетата. Этот экстракт объединяют с экстрактом из фильтрата и объединенный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на колонке, заполненной 750 г сили-jg кагеля (Вако-гель С-200) с хлороформом, и через колонку пропускают смесь хлороформа и метанола (100:1). Активную фракцию концентрируют при пониженном давлении досуха, в результа40 те получают маслянистый остаток. Затем остаток растворяют в небольшом количестве ацетона и адсорбируют раст вор на колонке с Сефадексом LH-20, заполненной ацетоном, и элюируют аце45 тоном. Полученную таким образом активную фракцию концентрируют для получения сырых кристаллов антибиотика 6270. Кристаллы растворяют в этилацетате и встряхивают с разбавленной

5Q соляной кислотой. Этилацетатный слой концентрируют при пониженном давлении. Образовавшиеся кристаллы пере- кристаллизовывают из смеси н-гексана и этилацетата, в результате получают

ее 23,4 г свободной кислоты антибиотика 6270 в виде бесцветных иглоподоб- ных кристаллов. Полученная таким образом свободная кислота антибиотика 6270 обладает упомянутыми физико-химическими и биологическими характеристиками,

П р и м е р 2. Антикокцидиозная активность.

Антибиотик 6270 однородно смешивают со сложным кормом для кур, чтобы получить заранее определенную концентрацию. Полученный таким образом корм свободно поедается курами в те- чение двух дней до инокуляции ооцита ми и до конца испытания (восемь дней после заражения).

Для сравнения используют Моненсин который является известиным антикок- цидиозным препаратом.

Используют цыплят в возрасте 7 дней которых содержат в условиях полного предохранения от кокцидиозной инфекции по 5 в группе.

Ооциты, использованные для заражения, представляют собой чувствительный штамм Eimeria tenella. Каждому цыпленку инокулируют полностью выросшие ООЦИТЫ (3 Ю) орально с использованием металлического зонда. Результаты представлены в табл.2.

Эффект от применения средства определяют по Аитикокцидиальному Индексу (ACI), который рассчитьтают по следующей формуле:

ACI (Относительное увеличение веса + доза выживания)-(ооцитная величина + показатель заболеваемости);

120 или менее: как антикокцидиоз- ный агент неэффективен;

160 или менее: слабо эффективен;

160-180: умеренно эффективен;

180 или вьпие: очень эффективен.

(i) Относительное увеличение веса

В конце испытания определяют увеличение веса (а именно вес в конце испытания - вес во время заражения) каждой испытуемой группы и вычисляют относительное увеличение веса на основе веса контрольной группы(100), которая не получает антикокцидиозное средство.

(ii) Ооцитовый индекс.

Число ооцитов в слепой кишке под- считывают через 8 дней после заражения путем гомогенизации кишечного канала. Ооцитовый индекс определяют следуюпщм образом.

Число ооцитов, май- Ооцитовый ий-

денных в кишечном деке

канале 0,0-0,110 0,1-1,0-10

О 1

1,0-5,0-10 5,0-11,0-10 11,0-10

10 20 40

(iii) Показатель заболеваемости кишечного канала.

Испытуемых цьтлят анатомизируют в конце опыта (8 дней после заражения) и исследуют кишечный канал невооруженным глазом, чтобы определить пЬказатель заболеваемости. Показател заболеваемости определяют, как приведено ниже, а величина заболеваемости была определена в десять раз, так же как и величина показателя заболеваемости.

О,(-) Кишечник совершенно нормальный. Если найдено пятно крови, (-) меняется на (),

I,(+) Кишечник нормальный по форме . Его содержимое слегка жидкое и желтоватое. Обнаруживается слабое набухание частично на слизистой мембране кишечника, который становится беловатым.

2,() Кишечник обычно нормальный по форме. Набухание наблюдают на всей поверхности слизистой мембраны. В содержимом крови не найдено. Слизь слегка желтоватая и поблекшая. На слизистой мембране обнаружено немного белых некротических пятен или кровяных пятен.

3,() Кишечник заметно усох и изменен по форме, он немного длиннее, чем прямая кишка. Содержимое с овер- шенно аномально и часто кишечник заполнен свернувшейся кровью или бело- серым, творогоподобным перерожденным веществом. Стенка кишечника заметно набухшая и легко рвется, а иногда еще остаются пятна крови. Болезнь затрагивает основание кишечника, но

не прямую кишку.

4,() Усыхание и деформация кишечника являются значительньпчи. Кишечник выглядит подобным колбасе по форме и не длиннее прямой кишки. Болезнь поражает треть или четверть прямой кишки.

Группы 1-3 получают.корм, содержащий заранее определенную концентрацию антибиотика 6270, начиная за два дня до инокуляции ооцитов. Группа 4 для сравнения получает корм, содержащий антибиотик Моненсин. Группа 5 представляет собой зараженную, не получавп1ую лекарства контрольную

9

группу, инокулированную ооцитами. Группа 6 представляет собой незара- жеиную контрольную группу, не получавшую лекарства.

Из этих результатов испытаний видно, что антибиотик 6270 обладает антикокцидиоэной активностью.

П р и м е р 3. Тест на эффективность корма на свиньях.

Используют свиней пород Land.

Основной корм;

а)с начала испытания до четырех недель: 60% зерна (кукуруза, пшеница ячмень), 15% соевого ткмыха, 15% кор- ма жи вотного происхождения (порошок снятого молока рыбная мука, и 10% другого (ферменты, карбонат кальция, фосфат калия, хлористый натрий и др.

б)от 4 до 12 недель: 78% зерна (кукуруза, ногоплодник ржавый, пшеница), 13% соевого жмыха, 5% рыбной муки и 4% других (карбонат кальция, фосфат кальция, хлористый натрий и

т.п.) .

Методика.

Разделяют на три группы 15, поросят 35-дневного возраста, в каждой группе по пять свиней, таким образом чтобы средний вес был одинаковым. Антибиотик 6270 добавляют к основному корму в количестве 0,12.5 и 25 млн долей (ппм) соответственно. Три группы свиней кормят кормами соответственно 12 недель. Затем измеряют вес телаи потребление корма.

Далее подсчитывают общее число дней, во время которых свиньи страдали от диарреи в течение четыре недель от начала испытания. Резуль- таты приведены в табл.3.

Показатель потребности в пище улучшается на 5-8% при кормлении кормом, содержащим антибиотик 6270. Повышение веса улучшилось на 5-11%. Кроме того, наблюдается, что диаррея у свиней с тцественно снизилась.

0

0 5

0

5

5

132iO

Пример 4 .. Эффек гивнос гь корма у жвачных.

Используют бычков породы Голь- штейн.

Концентрированный корм: 71,5% зерна (кукуруза, ногоплодник ржавый) miro (ячмень) 11,5% мякины и отрубей (кормовая клейковина кукурузы, пшеничные отруби, масляный жмых рисовых отрубей), 5,5% жмыха растительных масел (соевый жмых, жмых от льняного масла) и 11,5% другого (арахисовая мука, меласса, фосфат кальция, хлористый натрий).

Методика.

15 кастрированных бычков в возрасте 8 месяцев разделяют на три группы по пять бычков в каждой таким образом, чтобы средний вес был одинаковым. Добавляют антибиотик 6270 к основному концентрированному корму в количестве 0,7,5 и 15 ппм соответственно. Три группы бычков кормят этими кормами соответственно. Кроме того, высушенную рисовую солому скармливают в качестве сырого корма в количестве 1 кг на бычка. Результаты показаны в табл.4.

1

Показатель потребности в концентрированном корме улучшается на 7-10% при кормле1ши кормом, содержаи1;им антибиотик 6270. Прибавка веса увеличивается на 9-11%.

Формула изобретения

Способ получения антибиотика 6270, обладающего противококцидиозным действием, зг.кл oчaюш йcя в культивировании штамма Nocardiopsis sp.FERM ВР-717 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли при 30°С в течение 96 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Bacillus cereus IAM-1729

Bacillus cerculans IFO 3329

Bacillus subtilis PCI 219

Micrococcus flavus IFO 3242

Sarcina lutea NIHJ

Staphylococcus aureus

FDA 209PJC-1

Staphylococcus aureus

(устойчив к пенициллину, стрептомицину, хлорамфениколу, , тетрациклину и канамицину)

Esherichia coli NIHJ JC-2

Escherichia coli (устойчив к стрептомицину, каиамицину, хлорамфениколу и тетрациклину)

Klebsiella pneumoniae PCI 602

Proteus vulgaris OX-19

Pseudomonas aeruginosa IFO-3756

Mycobacterium smegmatis ATCC 60

Mycobacterium aviura IFO 3153

Mycobacteriura phlei NIHJ

Penicillium chrysogenum 0-176

Aspergillus flavus ATCC 96A3

Cochliobolus miyabeames

Alfernaria mari

Candida albicans YU 1200

Saccharomyces cerevisiae

Strain 77

1409132 Т а

1 2

блица I

a a

a a a b

b b

с с

показатель потребности пи

Улртвение показателя потребности пище, X

Средне количество корма, съеленного i во время периода нспытаямй Среднее увеличение веся во вреня nepi;ona испытаний

Показатель потребности в пине, когда бьст до8авле1 6267 Показатель потребности в пнце,когда не был добавлен аятибиотш

Показатель потребяостн в концентрированном корме

Sl SS 2i in I22 E2Et;5x bSS KS2 2 52 5EeSS 2 ni I 5 f9 Средняя прибавка веса за время испытаний

Улучшение показателя потребности в кон- цеитрированном корне

. Показа тел b noT2e6HOCTH B K02Mej Korga n HeaB{ieH 6267 Показатель потребности в корне, когда ие добавляли антибиотик

Тяблиця 3

Таблиц