ШТАММ Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887 - ПРОДУЦЕНТ БЛЕОМИЦИНА A И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА БЛЕОМИЦИНА A Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12P19/58 C12R1/465 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента противоопухолевого антибиотика блеомицина, широко используемого в терапии плоскоклеточного рака и ряда других типов опухолей.

Противоопухолевый антибиотик блеомицин, широко применяемый в медицинской практике (Bleocin, Nippon Kayaku, Japan и Blenoxan, Bristol Mayor׳s, USA) является смесью нескольких гликопептидных компонентов, наиболее терапевтически ценным из которых является блеомицин А₂.

Известен штамм Streptoverticillium subsp. Bleomycini 1129 - продуцент антибиотического комплекса блеомицинов [1]. Недостатками данного штамма являются содержание в его культуральной жидкости нескольких близкородственных блеомицинов, что затрудняет выделение и очистку целевого антибиотика, а также низкая антибиотическая активность.

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент однокомпонентного блеомицина А₂ в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина, УФ-излучения и гамма-лучей ⁶⁰Со на исходный штамм №1129 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих аминоэтилцистеин, карбамоилцистеин, канаванин, метилтреонин в качестве селективных агентов.

Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКПМ-S887.

Штамм ВКПМ-S887 обладает высокой продуктивностью однокомпонентного блеомицина А₂ (140 мкг блеомицина А₂ в 1 мл культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ВКПМ-S887. Температура 37°C; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культуры штамма, выращенного на овсяном агаре. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (таблица):

Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия прямые или извилистые, цепочки спор прямые, расположены мутовчато, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб растет при (24-37)°С; оптимум - 37°С, желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует глюкозу, фруктозу, сахарозу, лактозу; умеренно - инозит, арабинозу, рафинозу, слабо - маннит; не использует ксилозу.

Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозонитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и грамотрицательных бактерий Bacterium paracoli, Commomonas terrigena, дрожжей Saccharomyces cerevisiae; не действует на Escherichia coli. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.

Штамм ВКПМ-S887 поясняется следующим примером:

Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887, выращенной в течение (7-10) суток на овсяной агаровой среде, засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл) и выращивают (18-24) часа при 37°С на качалке при (220-240) об/мин. Состав посевной среды, %:

Глюкоза 1,0 Соевая мука 1,5 Глицерин 3,0 Натрий хлористый 0,3 Мел 0,5 Вода Водопроводная рН до стерилизации 6,8

Выросшим мицелием в количестве (3-5) % засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл) следующего состава, %;

Глицерин 1,0 Соевая мука 2,0 Кукурузный экстракт 0,5 Цинк сернокислый 0,1 Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,3 Вода Водопроводная рН до стерилизации 6,8

Ферментацию проводят на качалке при (200-220) об/мин, 28°С в течение 144 час. Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом тонкослойной хроматографии с биологическим проявлением по Bacillus subtilis ATCC 6633. Содержание блеомицина А₂ в культуральной жидкости продуцента к концу ферментации составляет 140 мкг/мл.

Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является более чем в 10 раз повышенная продуктивность и однокомпонентность антибиотика, а именно, содержание многокомпонентного антибиотического комплекса в культуральной жидкости штамма-прототипа 10 мкг/мл, в заявленном штамме 140 мкг монокомпонентного блеомицина А₂ в 1 мл. Высокая активность нового штамма Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887 определяет перспективность его использования для создания нового лекарственного препарата блеомицина на основе промышленного производства блеомицина A₂.

Блеомицин выделяют из культуральной жидкости, полученной в результате биосинтеза штамма-продуцента ВКПМ-S887, сорбцией на карбоксильной смоле КБ-2 в солевой форме. Смолу промывают 0,5 М раствором уксусной кислоты и антибиотик десорбируют 0,25 н. раствором соляной кислоты. После повторной сорбции на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме блеомицин элюируют 0,15-молярным водным буферным раствором уксуснокислого аммония с рН 6,5 и проводят дальнейшую очистку на сорбенте "Стиросорб MN-200». Полученный таким образом раствор антибиотика обеззоливают, концентрируют и блеомицин А₂ осаждают ацетоном из водно-метанольного раствора при рН (4,0-4,5) в форме гидрохлорида. Общий выход блеомицина А₂ не менее 70%.

Блеомицин А₂, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887, представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде, метаноле, ограниченно - в этаноле и не растворим в других органических растворителях. По физико-химическим свойствам, антибактериальной и противоопухолевой активности и токсичности полностью соответствует стандартному образцу блеомицина А₂. Брутто-формула: C₅₅H₈₄N₁₇O₂₁S₃·4НС1. Мол. масса 1561 а.е.м.

УФ-спектр: λ_max (вода)нм=243; 290.

Мол. масса основания (метод MALDI-TOF-MS)=1417 (М+2Н) и 1439 (M+Na⁺+H);

Культурально-морфологические признаки штамма Агаровая среда Рост воздушного мицелия* Цвет мицелия Растворимый Воздушного Субстратного Пигмент №1 Гаузе ++ Белый (Д3) до розоватого (Г2) Бесцветный Нет Овсяная +++ Белый (Д3) Бесцветный Нет Чапека +++ Белый (Д3), До розоватого (Г3) Бесцветный Нет Глюкозо-аспарагиновая +++ Белый (Д3) до розоватого (Г3) Бесцветный Нет Линденбайна (глицерин-нитратная) ++ Белый (Д3) Бесцветный Нет Глюкозо-нитратная №2 Гаузе ++ Белый (Д3) Бесцветный Нет Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом) Меланоидные пигменты не образуются */+++ - хороший; ++ - умеренный;

ЛИТЕРАТУРА

1. SU, авторское свидетельство, №563818.

Изобретение относится к новому штамму - продуценту антибиотика блеомицина и его использованию в биосинтезе противоопухолевого антибиотика блеомицина А₂, эффективного при лечении плоскоклеточного рака и ряда других типов опухолей. Штамм-продуцент Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887 получен в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина, УФ-излучения и гамма-лучей ⁶⁰Со на исходный штамм №1129 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих аминоэтилцистеин, карбамоилцистеин, канаванин, метилтреонин в качестве селективных агентов. Полученный штамм №7-99 депонирован в ВКПМ под номером S887. Штамм по сравнению с исходным штаммом обладает более чем в 10 раз повышенной продуктивностью. Продуцируемый штаммом продукт представляет собой однокомпонентный антибиотик - содержание антибиотического комплекса в культуральной жидкости штамма по изобретению составляет 140 мкг монокомпонентного блеомицина А₂ в 1 мл. Чистота целевого продукта достигается хроматографией элюата с КБ-2 на сорбенте "Стиросорб MN-200», на котором сорбируются только примеси. Высокая активность нового штамма ВКПМ-S887 определяет перспективность его использования для промышленного производства блеомицина A₂. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

1. Штамм Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887 - продуцент антибиотика блеомицина А₂.

2. Способ получения антибиотика блеомицина A₂ путем биосинтеза штамма-продуцента, сорбции антибиотика из нативного раствора, элюции антибиотика с последующим его выделением, концентрацией и осаждением, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ- S887, сорбцию примесей проводят на сорбенте "Стиросорб MN-200", раствор антибиотика обеззоливают, концентрируют и осаждают ацетоном в форме гидрохлорида.