СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОТИАЗИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/48 

Описание патента на изобретение RU2301421C2

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики, а именно к способам определения производных фенотиазина в биологических объектах методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Известны различные способы определения лекарственных веществ в биологических объектах, по количественному содержанию которых можно судить об эффективности лечения данным препаратом.

Известен способ определения пармидина в биологических жидкостях (Пат. RU 2008668, МПК (5) G01N 30/06). Биологическая проба обрабатывается смесью 0,1н. серной кислоты и этанола, взятых в соотношении 10-50:50-90. Затем ее центрифугируют и определяют пармидин в супернатанте методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Известен способ количественного определения перфеназина в моче евразийской выдры методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (Journal of Chromatography, 2002, 769, 79-87). Метод включает энзиматический гидролиз, в котором 2 мл образца доводят до рН 5,2 ацетатным буфером, добавляют β-глюкоронидаза-арилсульфатазу из Helix pomatia и инкубируют при 55°С в течение 2 ч. Твердофазную экстракцию с использованием картриджа Bond Elut Certify, который предварительно кондиционируют 2 мл метанола и 2 мл деионизованной воды. Пропускают через картридж анализируемую пробу и трижды промывают картридж сначала 2 мл деионизованной воды, 1 мл 1М уксусной кислоты и 2 мл метанола и высушивают картридж. Далее промывают картридж 2 мл смеси хлороформ - 2-пропанол в соотношении 8:2, содержащей 2% аммиака. Полученный экстракт высушивают и модифицируют с MSTFA до O-TMS производного. Полученное производное анализируют методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии.

К недостаткам известного способа относится трудоемкость, многооперационность пробоподготовки и использование сложного аппаратурного оформления.

Известен способ ТСХ-скрининга мочи (С.К. Еремин, Б.Н. Изотов, Н.В. Веселовская «Анализ наркотических средств», 1993). 50 мл Мочи подкисляют 2 н. соляной кислотой до рН 1-2. Двукратно экстрагируют 50 мл эфира по 3-5 минут. Эфирные вытяжки объединяют в экстракт 1. Водную фазу доводят до рН 9 добавлением аммиака и двукратно экстрагируют 50 мл смеси хлороформ - н-бутанол (9:1) в течение 3-5 минут. Органические вытяжки объединяют в экстракт 2. Органические растворители из экстрактов 1 и 2 удаляют в испарительных чашках в токе теплого воздуха. Сухие остатки экстрактов 1 и 2 растворяют в 10 мл хлороформа каждый. Далее проводят хроматографическое определение методом тонкослойной хроматографии. Используют одну из смесей растворителей: хлороформ - ацетон (9:1); диоксан - хлороформ - ацетон - 25%-ный аммиак (47,5:45:5:2,5); бензол - диоксан - 25%-ный аммиак (60:35:5); этилацетат - ацетон - (этанол - 25%-ный аммиак 1:1) (50:45:4); толуол - ацетон - этанол - 25%-ный аммиак (45:45:7,5:2,5); бензол; метанол - 25%-ный аммиак (100:1,5).

К недостаткам этого способа относится трудоемкость, многооперационность пробоподготовки и большой расход реагентов.

Известен способ количественного определения L-нафтола в моче животных с использованием жидко-жидкостной экстракции (Пат. RU 2011992, МПК (5) G01N 33/50). Согласно этому способу, 10 мл образца с добавкой определяемого вещества подщелачивают 20%-ным раствором едкого натра до рН 9-10 и проводят извлечение методом жидко-жидкостной с использованием 10 мл хлороформа в течение 2-3 минут, декантируют экстракт и отбрасывают, вносят 20%-ный раствор уксусной кислоты до рН 1-2, экстрагируют 10 мл хлороформа в течение 1-2 минут. Хлороформ отделяют, обезвоживают и упаривают до объема 30-50 мкл, наносят на пластинку и хроматографируют в системе гексан - ацетон (3:1), высушивают на воздухе и проявляют 0,2%-ного раствором прочного синего Б.

Недостатками этого способа являются высокая трудоемкость, связанная с большим количеством операций, обусловленных подготовкой образцов, и недостаточная селективность извлечения определяемого компонента.

Наиболее близким аналогом к заявляемому является способ количественного определения препаратов фенотиазинового ряда в биологических жидкостях (Пат. SU 826242, МПК (5) G01N 33/52). Согласно этому способу, определяемые вещества экстрагируют и разделяют методом жидкостной хроматографии на сильном катионите. В качестве элюентов используют смесь этанола и воды, взятых в соотношении 1:5-5:1 по объему с добавлением 0,1-5,0% смеси уксусной кислоты и диэтиламина в соотношении 5:4.

К недостаткам этого способа относятся высокая трудоемкость процедуры пробоподготовки, недостаточная селективность извлечения, а также использование сложного аппаратурного оформления.

Технической задачей заявляемого изобретения является разработка метода определения производных фенотиазина в биологических жидкостях методом тонкослойной хроматографии с использованием твердофазного извлечения определяемых компонентов.

Для решения технической задачи биологическую жидкость смешивают с этанолом и щелочью в соотношении 10:1:1 так, чтобы рН полученного аналита составлял 10-13 ед. рН. Общий объем аналита не должен превышать 16 мл. Подготовленный таким образом аналит пропускают через патрон, заполненный сверхсшитым полистиролом. Остатки воды и этанола удаляют, продувая патрон азотом. Экстрагированные на твердом сорбенте производные фенотиазина вымывают хлороформом объемом не более 8 мл. Из полученного элюата отдувают хлороформ в токе азота. Сухой остаток растворяют в небольшом объеме хлороформа и анализируют методом тонкослойной хроматографии. В качестве элюента может быть использована смесь ацетона и аммиака в соотношении 100:1.

Заявляемый способ отличается от прототипа тем, что на стадии подготовки аналита используется не жидко-жидкостная, а твердофазная экстракция определяемых веществ из аналита при подобранных компонентах и их соотношении, обеспечивающая одновременное извлечение и очистку от примесей при минимальном расходе растворителя. Обработка биологической жидкости щелочью до рН 10-13 обеспечивает переведение определяемых веществ в молекулярную форму, улучшая их сорбируемость, а добавка этанола уменьшает сорбцию мешающих веществ. Используемое упаривание в токе азота не требует нагрева элюата. Патрон с сорбентом может использоваться многократно. Кроме того, для приведения патрона в рабочее состояние его необходимо промыть последовательно 5 мл этанола, 5 мл 20% этанола и 5 мл дистиллированной воды.

Таким образом заявленная совокупность существенных признаков является новой и позволяет получить технический результат, не известный из уровня техники, то есть соблюдено требование изобретательского уровня.

На фиг.1 представлена зависимость оптической плотности элюата от объема прокаченной смеси вода - этанол (9:1) через патрон; на фиг.2 - зависимость оптической плотности элюата от объема прокаченной смеси вода - этанол (8:2) через патрон; на фиг.3 - зависимость оптической плотности этанольного раствора от объема прокаченного через патрон хлороформа; на фиг.4 - схема хроматограммы смеси семи производных фенотиазина.

При изучении эффективности очистки пробы от посторонних веществ изучили сорбцию производных фенотиазина из водно-органических смесей. Известно, что добавка органического растворителя к водному раствору вещества уменьшает его сорбцию на твердом полимерном сорбенте. В качестве такой добавки использовали этанол. Для этого готовили растворы производных фенотиазина в водно-этанольных смесях с концентрацией производных фенотиазина 5 мкг/мл каждого и порциями по 2 мл прокачивали через патрон, измеряя оптическую плотность каждой порции элюата. В первом случае использовали соотношение воды и этанола 9:1 (см. фиг.1). Измерения проводили при длине волны 254 нм, оптическая плотность фонового раствора составляла 0,05. Как видно, при пропускании через патрон до 16 мл смеси определяемые вещества остаются на сорбенте. Во втором случае использовали соотношение воды и этанола 8:2 (см. фиг.2). Оптическая плотность фонового раствора при 254 нм составляла 0,09. В этом случае после прокачивания 2 мл смеси производные фенотиазина начинали вымываться с сорбента.

Для подтверждения эффективности использования щелочной среды приготовили растворы аминазина с рН 6 и 10. Прокачали через патрон и вымывали этилацетатом. Элюирование проводили порциями по 2 мл, элюат высушивали и растворяли в 2 мл этанола и затем измеряли оптическую плотность. В качестве максимального объема элюирования взяли объем равный 10 мл. После прокачивания 10 мл этилацетата оптическая плотность спиртового раствора в первом случае составила 0,56, а во втором 0,24. Этим экспериментом было выявлено, что эффективно использование щелочной среды с рН 10-13.

С целью минимизации объема элюата и оценки эффективности извлечения изучали процесс десорбции производных фенотиазина с применением различных органических растворителей. Так как большинство органических растворителей имеют полосы поглощения в УФ-области спектра, совпадающие с максимумами поглощения производных фенотиазина, каждую порцию элюата упаривали досуха в токе азота и сухой остаток растворяли в этаноле. Оптимальным растворителем с точки зрения его объема, необходимого для полного элюирования производных фенотиазина с поверхности сорбента, оказался хлороформ (см. фиг.3). На патрон наносили смесь семи фенотиазинов по 50 мг каждого.

Пример 1. Определение аминазина

Смешивают 10 мл мочи с добавкой аминазина в количестве 10 мкг, с 1 мл этанола и 1 мл 0,01 М NaOH и прокачивают смесь через патрон со сверхсшитым полистиролом (230 мг) со скоростью 1 мл/мин. Продувают патрон азотом для удаления остатков пробы. Смывают аминазин 8 мл хлороформа. Полученный экстракт высушивают в токе азота и добавляют 0,2 мл хлороформа. Наносят экстракт на стартовую линию на пластинку. Помещают пластинку в предварительно подготовленную камеру. В качестве элюента используют смесь ацетон - аммиак (100:1). После завершения процесса элюирования пластинку высушивают и опрыскивают 10%-ным раствором серной кислоты в этаноле. Фиксируют проявившееся определяемое вещество, а также сопутствующие соединения. Значение Rf аминазина составило 0,67.

Пример 2. Определение смеси производных фенотиазина

Смешивают 10 мл мочи с добавкой смеси производных фенотиазина в количестве 10 мкг каждого, с 1 мл этанола и 1 мл 0,01 М NaOH и прокачивают смесь через патрон со сверхсшитым полистиролом (230 мг) со скоростью 1 мл/мин. Продувают патрон азотом для удаления остатков пробы. Смывают производные фенотиазина 8 мл хлороформа. Полученный экстракт высушивают в токе азота и добавляют 0,2 мл хлороформа. Наносят экстракт на стартовую линию на пластинку. Помещают пластинку в предварительно подготовленную камеру. В качестве элюента используют смесь ацетон - аммиак (100:1). После завершения процесса элюирования пластинку высушивают и опрыскивают 10%-ным раствором серной кислоты в этаноле. Фиксируют проявившиеся определяемые вещества, а также сопутствующие соединения (см. фиг.4).

Из представленного следует сделать вывод, что предложенный способ определения производных фенотиазина в биологических жидкостях прост, доступен, эффективен и обладает высокой селективностью.

Похожие патенты RU2301421C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИЦИНА И ПСЕВДОГИПЕРИЦИНА 2015
  • Пунегов Василий Витальевич
  • Чуча Константин Витальевич
  • Эчишвили Эльмира Элизбаровна
RU2623084C2
Способ подготовки проб мочи на принципах мицеллярной экстракции для определения содержания адреналина 2022
  • Булатов Андрей Васильевич
  • Вах Кристина Степановна
  • Каспер Светлана Васильевна
RU2800474C1
Способ определения N-(бензимидазолил-2)-О-метилкарбамата в биологическом материале 2018
  • Шорманов Владимир Камбулатович
  • Коваленко Евгений Анатольевич
  • Щербаков Денис Павлович
  • Жуков Иван Михайлович
RU2692127C1
Способ получения производных винбластина или их эпимеров 1981
  • Лайош Данчи
  • Тибор Кеве
  • Дьердь Фекете
  • Эстер Дежери
  • Шандор Герег
  • Тибор Ач.
  • Чаба Сантаи
  • Лайош Сабо
  • Каталин Хонти
  • Шандор Экхардт
  • Иван Хинди
  • Шандор Керпель-Фрониуш
  • Жужанна Релле
  • Янош Шугар
SU1138033A3
СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ПЕНИЦИЛЛИНОВ ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ 2008
  • Дутов Алексей Александрович
  • Пинелис Иосиф Семенович
  • Цыдендамбаев Пурбо Будажапович
  • Турчина Елена Викторовна
  • Хышиктуев Баир Сергеевич
  • Никитин Денис Александрович
  • Терешков Павел Петрович
  • Федотова Анастасия Алексеевна
RU2374648C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ 2011
  • Шорманов Владимир Камбулатович
  • Королёв Владимир Анатольевич
  • Коропова Татьяна Фёдоровна
  • Алтухова Анна Александровна
RU2453848C1
Способ определения остаточных количеств феноксикарба в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 2020
  • Подгорная Марина Ефимовна
  • Диденко Надежда Александровна
RU2760530C1
Способ определения алкалоидов изохинолинового ряда в мачке желтом 1979
  • Ловкова Мая Яковлевна
  • Бузук Георгий Николаевич
  • Гринкевич Нелли Ивановна
SU943565A1
СПОСОБ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ КОМПЛЕКСА БИОФЛАВОНОИДОВ ОБЛЕПИХОВОГО ШРОТА 2020
  • Аверьянова Елена Витальевна
  • Школьникова Марина Николаевна
  • Малахова Анастасия Вячеславовна
  • Рожнов Евгений Дмитриевич
  • Кошелев Юрий Антонович
  • Баташов Евгений Сергеевич
RU2759297C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОВОКАИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ 2013
  • Шорманов Владимир Камбулатович
  • Коренман Яков Израильевич
  • Чибисова Татьяна Викторовна
  • Галушкин Святослав Геннадьевич
  • Ярош Кристина Николаевна
RU2546294C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 301 421 C2

Реферат патента 2007 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОТИАЗИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Изобретение относится к области клинической лабораторной диагностики, а именно к способам определения производных фенотиазина в биологических объектах методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Способ включает обработку анализируемой пробы биологической жидкости щелочью, экстракцию определяемых веществ, дозирование экстракта в токе инертного газа азота и хроматографическое определение производных фенотиазина, при этом обработку пробы биологической жидкости проводят этанолом и щелочью в соотношении 10:1:1 соответственно до рН 10-13, экстракцию определяемых веществ ведут на твердом сорбенте с использованием сверхсшитого полистирола, экстракт смывают с сорбента хлороформом объемом не более 8 мл, вновь высушивают его в токе азота, а хроматографическое определение производных фенотиазина осуществляют методом тонкослойной хроматографии, где в качестве элюента используют смесь ацетона и аммиака, взятые в соотношении 100:1 соответственно. Изобретение обеспечивает простоту, доступность, эффективность и высокую селективность способа. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.

Формула изобретения RU 2 301 421 C2

1. Способ определения производных фенотиазина в биологических жидкостях, включающий обработку анализируемой пробы биологической жидкости щелочью, экстракцию определяемых веществ, дозирование экстракта в токе инертного газа, азота и хроматографическое определение производных фенотиазина, отличающийся тем, что обработку пробы биологической жидкости проводят этанолом и щелочью в соотношении 10:1:1 соответственно до рН 10-13, экстракцию определяемых веществ ведут на твердом сорбенте с использованием сверхсшитого полистирола, экстракт смывают с сорбента хлороформом объемом не более 8 мл, вновь высушивают его в потоке азота, а хроматографическое определение производных фенотиазина осуществляют методом тонкослойной хроматографии, где в качестве элюента используют смесь ацетона и аммиака, взятые в соотношении 100:1 соответственно.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют объем аналита не более 16 мл.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2007 года RU2301421C2

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ФЕНОТИАЗИНОВОГО РЯДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ1Изобретение относится к области медицины,, а именно к методам анализа лекарственных препаратов.Известен способ количественного определения препаратов фенотиазиново- го ряда в биологических жидкостях путем экстракции их с последующим разделением жидкостной хроматографи- ей [1].Однако известный способ _трудоёмок, длителен' и не обеспечивает .высокой чувствительности и воспроизводимости результатов..Цель изобретения ~ повышение точности способа.Эта цель достигается путем экс- тр^кции препаратов с последующим ра^вделением жидкостной хроматографией. При этом хроматографию ведут на катионите, а в качестве элюентов ис- 20 пользуют смесь этанола и воды, взятых в соотношении 1:5 - 5:1 по объему с добавлением 0,1-5,0% смеси уксусной кислоты и дизтиламин'а в соотношении 5:4.' Способ осуществляют следующим образом.Образец биологической жидкости, содержащий один или несколько препа_- ратов фенотиазинового ряда, под- ' 30101525вергают экстракции при рН 9,5 хлороформом. Затем экстракт упаривают, остаток растворяют в этаноле и вводят в колонку длиной от 10 до 50 см, заполненную сильньм катионитом, например партисилом 10-SCX. Через колонку пропускают смесь этанола и воды с добавлением диэтиламина и уксусной кислоты. Время удерживания фенотиа- зиновых препаратов различно. Детектирование выходящих из колонки разделенных KONOTOHeHTOB осуществляют по поглощению УФ-света в проточной кювете. Поскольку все фенотиазиновые 'препараты характеризуются сильным поглощением УФ~света, такой метод детектирования гарантирует высокую чувствительность анализа. Содержание препарата опреде.пяют по калибровочному графику,Пример 1. , Построение калибровочного графика для анализа ч нонахлазина и этмозина.К 2 мл плазмы добавляют нонахла- зин и этмозин в виде водных райтво- ров соответствующих гидрохлоридов. Прибавляют 0,5 г сульфата аммония и 0,5 мл 10%-ного аммиака. Экстрагируют 2 раза по 5 мл хлороформа. Объединенный экстракт испаряют'в 1979
  • Пиотровский Владимир Константинович
  • Метелица Владимир Исакович
SU826242A1
Способ количественного определения производных фенотиазина 1977
  • Холап Анна Харлампиевна
  • Плигин Семен Григорьевич
SU726471A1
Способ идентификации производных фенотиазина 1985
  • Прокофьева Вера Ивановна
  • Митрягина Сусанна Федоровна
  • Егоренкова Галина Ивановна
  • Садчикова Наталья Петровна
  • Кирпичева Эльвира Ивановна
  • Глушакова Валентина Петровна
  • Фалина Раиса Ивановна
  • Кувырченкова Ирина Сергеевна
SU1286970A1
VENTURA R
ET AL
Quantification of perphenazine in eurasian otter (Lutra lutra lutra) urine samples by gas chromatography-mass spectrometry
J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life ScL, 25.03.2002, V.769, №1, P.79-87
US 4128399 A, 05.12.1978.

RU 2 301 421 C2

Авторы

Темердашев Зауаль Ахлоович

Киселева Наталья Владимировна

Клищенко Роман Александрович

Удалов Андрей Вениаминович

Даты

2007-06-20Публикация

2005-04-12Подача