Способ количественного определения формононетина в растительных материалах Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

|. Изобретение относится к химичес- |ким методам анализа изофлавоноидов IB растительных материалах и продукта |их переработки и может быть испрль- Зоваио для анализа формононетина и 1его гликозида - ононина в кормовых 1 травах, н белковых концентратах из {сока трав, в фармацевтических препа- ратах, при селекции люцерны и клеве- р а по химическому составу и определении их экстрогенной активности. Цель изобретения - повьшение чувствительности и точности способа.

Проводят экстракцию фенольных сое динений смесью этанола и воды, упарй вание, очистку и гидролиз экстракта, реэкстракцию флавоноидов органическим растворителем, хроматографирование экстракта на пластинке со слоем си- ликагеля в подвижной фазе, элюирова- ние формононетина с пластинки. В качестве подвижной фазы используют систему растворителей хлороформ - метанол - вода при объемном соотношении компонентов (93-97):(7-3):(Oj5- 1,5), а количество формононетина опг ределяют флуориметрическим способом после добавления к элюату 0,03 - 0,21 мл 0,05 М раствора гидроксида натрия в метаноле.

При флуориметрировании элюата используют фильтр возбуждения Я 254 нм, фильтры пропускания 450 нм. Чувствительность определения формононетина составляет от 0,4 до 1,0 мкг/г.

|. Пример. Определение содер- ,|жания формононетина в растительной муке..

Навеску люцерновой муки 10 г экстрагируют. 40-50 мл 90%-ного этанола на глицериновой или водяной бане (t 60-70°С) в колбе с обратным холодильником в течение 20-30 мин. Извлечение повторяют 4-5 раз. Полученные экстракты объединяют, отфильтровывают и упаривают до водного остатка. Последний очищают в делительной воронке петролейным эфиром 5 6 порциями (по 50 мл) до тех пор, пока органическая фаза не становится бесцветной или слабо-желтой. Очищенный водный остаток упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха гидролизуют его при нагревании в течение 3 ч с 5-10 мл 10%-ной серной кислоты. Агликоны фенольных соедине- . НИИ извлекают из гидролизата 5-6 пор0

5

0

5

0

5

0

Циями этилацетата. Этилацетатные экстракты объединяют, упаривают досуха, растворяют в 5 мл метанола. Аликво- ту 0,01 мл метанольного раствора наносят в виде полосы на хроматогра- фическую пластинку Силуфол, предварительно промытую метанолом и активированную нагреванием в течение 30 мин при .

Разделение проводят в камере с насыщенной атмосферой в системе растворителей хлорофом - метанол - вода (95:5:1). По окончании раздёлен йя плас,тинку сушат на воздухе 5-10 мин, на 1-2 мин опускают в камеру, .насыщенную парами аммиака, а затем облучают УФ-светом fl 253 нм. Формоно- нетин обнаруживают по светло-голубой флуоресценции с пфмощью метки-свидетеля или по величине R, 0,27±0,02. Флуоресцирующую в УФ-свете полосу очерчивают. Соскребают силикагель q анализируемым веществом с роматогра- фической пластинки и ;заливают 5 мл химически чистого метанола,-Смесь периодически встряхивают. Адсорбент вьщерживают в контакте с растворителем в течение 12-15 ч. Затем силйка гель отделяют, используя мелкопористый бумажный фильтр. Добавляют к фильтрату 0,05 мл 0,05 М раствора NaOH в метаноле и измеряют флуоресценцию полученного раствора. Проводят аналогичные процедуры для растворов сравнения - стандартного и фонового.

Содержание формононетина в растительном сырье определяют по формуле

§§l lll$l$2l

а.(Фо- Ф)

X

5

0

5

где X - содержание формононетина в

растительном сырье, мг /г; 286 - молекулярная масса формононетина;

Y - объем метанола для растворения сухого остатка суммы фенольных соединений ((5 мл)

-концентрация стандартного раствора, моль/л;

-навеска растительного материала, г;

-интенсивность флуоресцен-, ции исследуемого раствора;

-интенсивность флуо1)еси;ен- ции стандартного раствора;

-интенсивность флуоресценции фонового раствора.

С

Ф

Ф

Ф

°Р

14

р 2. Приготовление стан

Приме

дартного и фонового растворов сравнения.

0,1 мл раствора формононетина известной концентрации наносят на пластинку и подвергают хроматогра- фическому разделению так же , как в примере 1. Все последующие процедуры проводят так же, как и для исследуемых экстрактов.

Фоновый раствор приготавливают по указанной методике из чистого сили- кагеля, удаляемого с пластинки с площади, примерно равной площади полос формононетина на исследуемых хрома- тограммах. Использование фонового раствора необходимо при измерениях на однолучевых флуориметрах. В дву- лучевых приборах фоновые растворы ис пользовать не нужно: флуоресценции растворителя, кюветы и примесей си- ликагеля учитываются автоматически.

П р и м е р 3. Одновременное определение количества формононетина и ононина 7-глюкозида формононетина). ; Извлечение фенольных соединений и очистка экстракта от липидов и хлоро филлов проводятся так же, как в примере 1. Очищенный экстракт упаривают до 20-30 мл, количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят этанолом до метки и разделяют полученный раствор на две равные части А и Б.

Часть А упаривают досуха и гидро- лизуют. -Затем повторяют все операции указанные в примере 1. Часть Б обрабатывают в той же последовательности, за исключением стадии гидроли за. Обнаруженное в растворе Б количество изофлавона соответствует содержанию в растительном сырье свободного формононетина - агликона.

Количество ононина вычисляют по формуле

ОНОНМЬ

2 (Хв- Xg)

или X

ононыи

-iX 2§§:9 l$«i $jl.

а (Фо- )

где Х

I -,

Хб

Фо

Ф

-общее содержание формононетина (гликозид + агликон, раствор А);

-содержание свободного формононетина (агликон, раствор Б);.

содержание гликозида фор - мононетина-ононина; интенсивность флуоресценции раствора А; интенсивность флуоресценции раствора Б (после обработки, так же, как в примере 1, исключая стадию гидролиза)

Формула изобретения

Способ количественного определения формононетина в растительных материалах,включающий экстракцию фенольных соединений смесью этанола и воды, упаривание,,очистку и гидролиз экстракта, реэкстракцию фпавонои- дов органическим растворителем,vxpo- матографирование. экстракта на пластинке со слоем силикагеля в подвижной фазе, содержащей хлороформ, элюи- рование формононетина с пластинки с последующим количественным определением, отличающийся тем, что, с целью повьшения чувствительности и точности способа, в качестве .подвижной фазы используют систему растворителей хлороформ - метанол - вода при объемном соотношении компонентов (93-97): (7-3);: (О 5-1,5), а количество формононетина определяют флуориметрическим способом после /jo- бавления к элюату 0,03-0,21 мл 0,05 М раствора гидроксида натрия в метано- .ле.

Изобретение относится к химическим способам анализа формононетина в растительных материалах и продуктах их переработки. Целью изобрете-t ния является повышение чувствитель, ности и точности определения. Из навески растительного материала этанот лом извлекают фенольные соединения, упаривают экстракт до водного остатка, последний очищают петролейным эфиром, упаривают досуха, гидролизу- ют 10%-ной серной кислотой. Из гидро- лизата извлекают этилацетатом фенольные соединения, разделяют их в тонком слое силикагеля с использованием подвижной фазы.состава хлороформ-мета-Нол-вода в соотношении (93-97): :(7-3):(0,5-1,5). Формононетин удаляют с хроматограммы и флуориметри- ( «б 254 нм; 1„,„„ 450 нм) с добавлением к анализируемому раствору 0,03-0,21 мл 0,05 М раствора гидроксйда натрия в метаноле. Чувствительность определения формононетина составляет 0,4-1,О мкг/г. (Л