Способ выделения миозина из мышечной ткани сердца Советский патент 1986 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии медицине, а точнее к биохимии и ммунологии. Предлагаемый способ ает возможность получить иммуноло- пчески чистые высокоактивные препааты миозина из любых поперечно-поосатых мьпиц (как скелетных, так и сердечных), которые могут быть использованы в энзШ Юлогических, в частности кинематических исследованиях при изучении тонкой структуры ышц, а также, в качестве чистого антигена при диагностике воспалитель ных процессов в мьппцах с помощью клеточных реакций - реакции пассивной гем.::}гглютянации, выявляющей про- тивокардиалъпые антитела, реакции торможения миграции лейкоцитов,реакции бласттрансформации лимфоцитов.

Цель изобрете1И1я - упрощение способа, повышение активности и выхода целевого продукта.

И р и мер 1. Получение препарата из сердца человека.

Сердце бра:п-1 через 1 ,5-2 ч после смерти, наступившей в результате несчастного случая. Миозин выделяли из левого желудочка. Проводили перфузию раствором Кребс-Хензеляйт при 37®С, удаляли предсердия, соединительную ткйнь, и, измельчив ножницами, гомогенизировали 4 раза по 10 с на высокоскоростном гомогенизаторе при 25000 об/мин в 2,5 обг емах буфера, содержащего 0,05 М KifjPOr, , 0,001 М ДТТ,0,0 М , 0,001 М ЭДТА, рН 6,8. Далее центрифугировали 15 мин при 10000 g и осадок вновь гомогенизировали в том же скоростном реж1)е 2 раза по 10 с в объемах среды, содержащей 0,3 М КС1, 0,1 М ,, 0,01 М Na/,PjO, 0,001 М ЭДТА, рП 6,8.Затем проводили экстракцию путем интенсивного перемешивания стеклянной палочкой в течение 7-8 мин и центрифугировали 15 мин при 10000 g. Полученный су- пернатант фильтровали через три слоя марли для удаления жира, а к фильтрату добавляли 9 объемов воды с 0,001 Н ЭДТЛ и доводили рН до 6,5-6,7 двухмолярным раствором НС1. Затем центрифугировали при 10000 g 13 мин, уплотненны осадок разводили средой, содержащей 0,01 М Трис- ИС1, 0,5 М KCL, 0,001 М Э/ДТЛ, 0,05 М y-ZCi и 0,001 М ДТТ, рИ 7,5 до концентрации 10 мг/мл, которую определяли по биурету. Центрифугировали 20 мин при 22000 g. Осветленный су- пернатант разбавляли до концентрации 4-6 мг/мл той же средой и добавляли

АТФ до конечной концентрации 0,002 Н.

Раствор выдерживали 10 мин при иериодическом помешивании, а затем центрифугировали в течение 1,5 ч при 180000 g с целью избавления от выпавшего в полимерной форме актина. Затем снижали ионную силу супернатанта от 0,5 до .0,3 М, разбавив его водой с ЭДТА, и доводили рН до 6,6.Раствор миОзина центрифупфовали при 15000 g

20 мин, освобождаясь от осаждавшегося актомиозинового комплекса.

Для удаления из раствора белка нуклеиновых кислот к супернатанту добавля;н1 составлявший 30% от объейа

сефадекс ДЕАЕ-25,предварительно заряженный и уравновешенный 0,1 М буфером рН 7,6, содержащим 0,2 М КСL. Через 15 мин сефадекс удаляли с помощью стеклянного фильтра g-1 . силу фильтрата увеличивали до 0,3 путем добавления ЗМ KCL.

Раствор белка с рН 6,6 разбавляли семью объемами воды с ЭДТА, доводили рН до 5,7 и центрифугировали

15 мин при 10000 g. Осадок с концентрацией 2 мг/мл, определенной по биурету, суспендировали в 0,05 М пичрофосфатном буфере рП 7,5, со-. держащем 0,001 М ЭДТА и 0,001 М ДТГ.

Затем вновь добавляли АТФ до конечной концентрации 0,002 Ы и проводили высаливание сухим сульфатом аммония при насыщении 35, 37,5 и 42,5%, чередуя прещ1питацию на холоде (0,5 с)

центрифугирование при 10000 g

15 мин, постепенно избавляясь от примесей. Количество добавляемой соли на каждой стадии высаливания рассчитывали но следующей формуле:

а) 0,515.V(S,-S,) 1-S, 0,272

V Si

82 - требующееся насыщение, - количество соли, г.

-объем раствора в мл

-исходное насыщение;

Фракцмо, полученную при 42,5% насыщения, диализовали в течение 2 сут. против 0,05 М Трис-НС 1, 0,001 М ДТТ и 0,5 М KCL, рН 7,5, а затем осветляли центрифугированием

312Д459

при 180000 g 1,5 ч, нижний слой су- пернатанта использовани в качестве собственно препарата миозина.Удельная активность полученного препарата составляла 2,0 ед,, выход 310 мг/ s /100 г ткани.

Пример 2. Получение препаратов миозина из сердец крысы, кроли-- ка, собаки. . Вьщеление проводили аналогично 10

Выход, мг/1 00 ткани

Активность, унив. ед.

Сердце крысы

Сердце кролика

Сердце собаки

280 1,5

320 . 1,0

300 1,5

Выделение миозин

.Пример 3. из скелетных мышц.

. Препараты были получены из: четырехглавой мышцы бедра человека; красных мышц кролика, белых мышц кролика.

Скелетные мышцы измельчали с помощью мясорубки после размораживания в 0,05 М фосфатном буфере, рН 6,8 + 0,001 М ЭДТА + 0,01 М пиро- фосфата натрия + 0,001 М ДТТ, а дал выделение проводили аналогично примеру 1. Выход составлял: для препарата из скелетной мышцы человека 280 мг/100 г ткани, а для препара- тов из белых и красных мьш1ц кролика 300 и 290 мг/100 г ткани соответственно .

Пример 4. Воспроизводимост предлагаемого способа.

В качестве критерия воспроизводимости использовалась средняя величина удельной активности вида препарата.

Количество

Удельная активность

(мкмоль/мин- мг экспе- белка) pfiMeH- тов

Сердце человека

2,07 ±0,11

5

0

Сердце

кролика 10

Сердце

собаки 10

Сердце

крысы 25

Белые

мышцы

кролика 20

Красные

мышцы

кролика 10

Скелетные МЬШ1цы человека 5

Максимальное отклонение от среднего значения активности препарата данного вида составляло не более 6% и не зависело от объекта.

Пример 5. Данные чистоты полученных препаратов.

Данные электрофореза в ПААГ.

1,0 ±0,05 1,5±0,08 1,5±0,09

1,6tO,1 0,5 to,02

0,14±0,01

Объект

с М.в ,.10

Примеси

с М.

0

5

0

5

0

5

Белые ш

мьшцы

кролика 0,5% 5%

Красные

мышцы

кролика 0,5% . 6%

Сердце

кролика 0,5% 6%

Сердце .

собаки 0,5% 6%

Сердце

человека 1% 9% О количестве примесей нуклеиновых кислот судили по соотношению Ei&o Егбо

Белые мышцы кролика 1,94 Красные мьш1цы кролика1,72 .Сердце кролика 1,76 Сердце собаки 1,75 Сердце человека 1,78 Сердце крысы ) Скелет-мышцы человека 1,75 Полученные препараты миозина являются иммунологически чистыми, что дает возможность использовать их в качестве чистых антигенов, в частности, при диагностике сердечных заболеваний. . Предлагаемый способ дает возможность получить высокоактивные препараты из любого вида поперечнополосатых мьпиц разных животных и человека. Время выделения сокращено по сравнению с известньм способом на 12 ч.

Формула изобретения

Способ выделения миозина из мышечной ткани сердца путем гомогенизации ткани, экстракции буфером, фильтрования, центрифугирования, хро матографии, фракционирования сульфатом аммония, последующего центрифугирования и диализа, о т л и ч а raРедактор Ю. Середа Заказ 3910/48

Составитель В. Кузьмичев

Техред Л.Олейник Корректоре. Шекмар

Тираж 778Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная,4

ni и и с я тем, что, с целью упрощения способа, повьппения активности и выхода целевого продукта, ткань го5 могенизируют 4 раза по 10 с при 25000-26000 об/мин, центрифугируют при 22000 g в течение 20 мин, актин удаляют из раствора с концентрацией белка 4-6 мг/мл центри10 фугированием при 180000-200000 g в течение 1,5 ч, миозин осаждают при рН 5,6-5,7, фракцию продукта .при насыщении 42,5 % сульфатом аммония диализируют и центрифугиру15 ют.

Изобретение относится к биохимии и иммунологии. Цель изобретеа 1973, хиния - упрощение способа, повышение активности и выхода целевого продукта. Мышечную ткань сердца гомогенизируют 4 раза по 10 с при 25000- 26000 об/мин в буфере. Затем центрифугируют при 22000 g в течение 20 мин. Актин удаляют из раствора с концентрацией белка 4-6 мг/мл центрифугированием при 180000- 200000 g в течение 1,5 ч. Миозин осаждают при рН 5,6-5,7. Фракцию продукта при насьпцении 42,5% сульфатом аммония диализуют и центрифугируют. Нижний слой супернатанта используют в качестве собственно препарата миозина. 4 табл. Q IND 4 4 сл