Способ получения растворимой @ -атфазы Советский патент 1984 года по МПК G01N33/50 

1&

sj

OD

Изобретение относится к биохимия и может использоваться для получения растворимой Н -АТФазы из митохондрий клеток головного мозга.

. Известен способ получения растворимой Н -АТФазы из митохондрий клеток сердца, включающий экстрагирование Н -АТФазы хлороформом 1.

Известен способ получения Н -АТФаэы из митохондрий сердца путем разрушения их ультразвуком 2.

Известен также способ получения растворимой Н -АТФазы путем освобождения митохондрий от внешних мембран в гипотонической среде, воздействия ультразвуком, экстрагирования и очистки целевого продукта высаливанием сульфатом аммония 3.

Недостатком данного способа является то, что он не приводит к выделе нию Н -АТФазы в раствор из-за ряда особенностей ткани головного мозга, отличающих ее от других тканей животного организма.

Цель изобретения - получение раст воримой Н -АТФазы из митохондрий головного мозга с большей удельной активностью..

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения растворимой Н -АТФазы путем освобождения митохондрий от внешних мембран в/ гипотонической среде, РОЗдействия ультразвуком; экстрагирования и очистки целевого продукта высаливанием сульфатом at- /юния клетки головного мозга очищают от миелина и синаптосом в градиенте плотности сахарозы 0,7; 1,2 М и 1,5 М, обрабатывают хлороформом и ультразвуком двукратно по 4-6 мин и затем однократно в течение 23-27 мин, а- перед высаливанием сульфатом аммония проводят изоэлектрическуга преципитацию, далее пробу инкубируют при б4°С, а целевой продукт повторно высаливают суль фатом аммония.

Способ осуществляют следующим образом.

Неочищенную фракцию митохондрий мозга очищают от миелина и синаптосом. Для этого суспензию неочищенных митохондрий центрифугируют в градиенте плотности сахарозы 0,7- 1,2- 1,-5 М при концентрации белка 1520 мг/мл при 60000 g в течение 120 мин..

Далее митохондрии освобождают от внешних мембран. Для этОго их сус пендируют в гипотонической среде (0,02 М трис-буфер, рН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды, вццерживают при 28-30 мин. Осадок суспендируют в растворе (0,9 М NaCl и 0,02 М трис-буфер, рН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды и центрифугируют при 6000 g в течение iCf мин,

Данную операцию повторяют еще один раз.

Полученные препараты контролируют на полному отделения внешних мемб ран методом электронной микроскопии, а также дифференциальной спектрофотометрией по исчезновению цитохромов С и BS .

Осадок суспендируют в среде (0,25 М сахароза, 10 мМ. трис-буфер и 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) . Суспензию полученных субмитохондриальных частиц (СМЧ) подвергают обезжириванию хлороформом. Для этого к суспензии СМЧ (20-30 мг белка/мл) добавляют . 0,5-0,6 объема хлороформа и легко помешивают в течение 3-4 мин. Затем смесь центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин.

Осгщок обезжиренных СМЧ суспендируют в среде (0,1 М сахароза, 10 мМ трис-буфер и 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) до концентрации 18-20 мг белка/мл. Суспензию подвергают действию ультразвука на холоде в течение 4-6 мин при частоте 22 кГц и токе . А на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДЧ-2Т.

Суспензию центрифугируют при 140000 g в течение 30 мин. Данную операцию проводят два раза.

Полученные ультразвуковые СМЧ разводят др концентрации 18-20 мг белка/ мп среды (0,1 М сахароза, 10 мМ трис-буфер и 1 1УМЭДТА, рН 7,5). Суспензию СМЧ подвергают действию ультрзвука непрерывно в течение 23-27 мин при частоте 22 кГц и токе на ультразвуковом дезинтеграторов . УЗДН-2 Т. Суспензию при этом не охлаждают. . .

После обработки суспензиюг центрифугируют при 200-250 тыс. g в течение 30 мим при температуре 18-20 С Супернатант (надосадочная жидкость) используют для дальнейшей очистки АТФазы.

Первым этапом очистки является изоэлектрическая преципитация. Для этого у супернатанта доводят рН До 5,4 1 н. уксусной кислотой. Раствор центрифугируют в течение 3-5 мин при 18000 g и температуре 15-18°С. При этом общее время выдержки рН 5,4 не должно превышать 10 мин, У супернатанта рН доводят до 6,8-7 ед сухим трисом.

На втором этапе очистки проводят высаливание сульфатом аммония. Для этого добавляют порошок сульфата аммония до концентрации 50% от насыщения, корректируя при этом рН трисом (6,8-7,0 ед, рН).

Раствор выдерживают на холхэде ( в течение 30-35 мин, а затем центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин. Осадок растворяют в среде (0,25 М сахароза, 0,001 М ЭДТА, 0,03 М АТФ и 0,01 М трис-буфер, РН 7,5) . Третий этап очистки - термическая обработка препарата. Для этого препараты АТФазы помещают в баню (), нагревают до и переносят в баню ), где ввдерживают в течение 4 мин. Затем раствор охлаждают при комнатной температуре до и центрифугируют при 18000 g в течение 10 мин. Осадок выбрасывают. К супернатанту добавляют порршок сульфата аммония до концентрации 50% от насыщения, корректируя при этом рН раствора сухим трисом на уровне 7,5 ед. рН. Полученный очищенный раствор Н -АТФазы можно хранить при 4 С. Для увеличения выхода АТФаэы про водят дополйительные операции: осадок после ультразвуковой обработки заливают средой (0,1 М сахароза, 0,001 М ЭДТА и 0,01 С трис-буфер, рН 7,5) и разводят до концентрации 20 мг белка/мл, добавляют 0,5-0,6 объема хлороформа, интенсивно встря хивая в течение 2-3 мкк. Центрифуги руют 10 мин при 10000 д. Супернатан отсасывают, центрифугируют 30 кщн при 200000 g и затем опять проводят очистку фермента. Пример, (минимальные знач ния параметров). Митохондрии головн го мозга получает, например, по мет ду Фонье и Шомодьи. Общий белок 4800 мг, общая активность 1632 мкМ .фосфора/мин и удельная 0,34 мкМ фос фара/мг мин. Фракцию митохондрий мозга суспендируют в 0,7 М холодной сахарозе и разводят до концентрации 8-20 мг белка/мл. Затем проводят центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 0,7-1,2-1,5 М (рН 7, в угловом роторе при 60000 g в тече ние 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную фракцию митохондрий. Общий белок 320,05 мг, общая активность 208,10 мкМ- фосфора/мин и удельная 0,518 мкМ фосфора/мг белка -мин. Затем митохондрии для, освобождения от внешних мембран суспендируют в гипотонической среде (0,02 М трис буфер,рН 7f5) из расчета 20 мг белка/мл среды и выдерживают при в течение 30 лин. Затем раствор центр фугируют 30 Мин при 10000 д. Осадок суспендируют в растворе соли (0,9 М NaCl и 0,02 М трис-буфер, рН 7,5) и расчета 20 мг белка/мл среды и цент рифугируют 10 мин при 6000 д. Эту процедуру проводят два раза. ООций белок 210 мг, общая активность 134,40 мкМ фосфора/мин,, удельная ак тивность 210 мкМ фосфора/мг мин. За тем в сусп,рнзии митохондрий, лишенных наружной мембраны, добавляют 0,4 объема хлороформа, перемешивают при 4С в течение 3-4 мин. Затем центрифугируют 10 мин при 10000 д. Супернатант выбрасывают. Осадок используют для получения УСМЧ. Общий белок 198 мг, Общая активность 116,82 мкМ фоофора/мин, удельная активность 0,59 мкМ фосфора/мг белка мин. Для получения УСМЧ осадок обезжиренных митохондрий разводят до концентрации 20 мг белка/мл среды (0,1 М сахароза, 0,001 .М ЭДТА и :0,01 М трис-буфер, рН 7,5) и затем воздействуют ультразвуком (22 кГц, 40jLx А) в течение 4 мин на холоде, при этом используют дезинтегратор УЗДН-2Т. Суспензию центрифугируют 60 мин при 140000 g и темдературе . Осадок снова подвергают действию ультразвука в течение 4 мин и центрифугируют 60 мин при 140000 g и температуре . Осадок суспендируют в исходной среде. Для экстракции Н -АТФазы ультразвуковые СМЧ разводят до концентраций 18-20 мг белка/МП среды (0,1 М сахароза, 0,001 М ЭДТА и 0,1 М трисбуфер, рН 7,5). Затем суспензию подвергают действию ультразвука (22 кГц, 40ji А) в течение 23 мин. После этого центрифугируют в тепле (15-18С) 30 мин при 200000-250000 д. Супернатант используют для дальнейшей очистки АТФазы. Осадок помещают в холодильник (-20°С) для дальнейшего получения фермента. Ойций белок 16,-23 мг, общая активность 69,78 мкМ фосфора/Мин, удельная активность 4,3 мкМ фосфора/мг белка-мин. Очистку АТФазы начинают с изоэлектрйческой преципитации. У супернатанта доводят рН 5,4 уксусной кислотой (1 н). Раствор сразу же центрифуригуют 3-5 мин при 18000 g, осадок выбрасывают. У супернатанта доводят рН до 6,8-7 сухим трисом (время экспозиции не больше 10 мин). Общий белок 3,18 мг, общая активность 15,58 мкМ фосфора/мин, удельная ai тквность 4,7 мкМ фосфора/мг балка-мин, К раствору фермента добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 50% от наолщения, корректируя при этом рН 7,0-7,5 трисом. Раствор ввдерживают 30 мин при температуре , затем центрифугируют 10 мин при 10000 д. Супернатант выбрасывают, осадок растворяют в среде (0,25М сахароза, 0,001.М, ЭДТА, 0,03 М АТФ и 0,001 М трис-буфер, рН 7,5) до концентрации 0,5 мг белка/МП. Раствор помакают в;баню с температурой , нагревают до 6.4С и быстро переносят в баню с температурой , где выдерживают в течение 4 мин. Общий белок 1,84 мг, общая активность 22,81 мкМ фосфора/мин, удельная активность 12,48 мкМ фосфора/мг .белка-мин. К супеЕ(натанту добавляют сульфат аммония до концентрации 50% от насы щения, корректируя рН 7,0-7,5 трисом. Общая активность фермента 12,01 мкМ фосфора/мин,удельная активность 11,, 7 мкМ фосфора/мг белка .Мин, общий белок 1,68 мг. Полученный белок обладает АТФазной активностью, устойчив к.олигоми цину и ингибируется циклометилкарбодинмидом (ЦМКД). П РИМ ер № 2 (оптимальные зна чения параметров). Получают митохондрии из головного мозга, например, по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 5406 мг, общая активность .1973 мкМ фосфора/мин, удельная актив ность 0,365 мкМ фосфора/мг ..мин. Фрак цию митохондрий мозга суспендируют в 0,7 М холодной сахарозе и разводят до концентрации 18-20 мг белка/мл. Затем проводят центрифугирование в градиенте плотности сахарозы 0, , 1,5 М (рН 7,5) в угловом рот.оре при 60000 g в течение- 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную фракцию митохондрий.Общий белок 340,03 мг,о щая активность 340,03 мкМ фрсфора/ми удельная активность 0,,613 мкМ фосф.о ра/мг белка мин. Затем митохондрии для освобождения от внешних мембран суспендируют в гипотонической среде (0,02 М трис буфер, рН 7,5) из расчета- 20 мг белка/мл среды и выдерживают при 4°С в течение 30. мин. Затем центрифугируют 30 мин при 10000 д. Ос-адок суспендируют в растворе соли (0,9 М NaCl и 0,02 М .трис-буфер, рН 7,5) из расчета 20 мг белка/мл среды и центрифугируют 10 мин при б-тыс. д. Эту процедуру проводят два раза. Общий белок 243,96 мг, общая активность 170,16 мкМ фосфора/мин, удель ная активность 0,712 мкМ фосфора/мг белка мин. Затем к суспецзии митохондрий, лишенных наружной мембра.ны, добавля ют 0,5 объема хлороформа, перемешивают и выдерживают при в тече-. ние 3-4 мин. Затем центрифугируют 10 мяк при 10000 д. Супернатант выбрасывают. Осадок используют для УСМЧ. Общий белок 210,81 мг,.общая активность 143-, 50 мкМ фосФора/мин, удельная активность 0,681 мкМ Фосфора/мг белка мин. Для получения УСМЧ осадок обезжиренных митохондрий разводят до концентрации 20 мг белка/МП среды (0,1 М сахароза, 0,001 М ЭДТА и 0,01 М трис-буферг рН 7,5) и затем воздействуют ультра звуком (22 кГц, 40ji А) в течение 5 мин на холоде, при этом используют дезинтегратор УЗДН-2Т. Суспензию центрифугируют 60 мин при 140000 g и температуре 0-4с. Осадок сйова подвергают действию ультразвука в течение 5 мин и центрифугируют 60 мин при 140000 g и температуре 0-4С. Осадок суспендируют в исходной среде. Для экстракции Н -АТФазы ультразвуковыеСМЧ разводят до концентрации белка 20 мг белка/мл среды (0,1 М сахароза, 0,001 М ЭДТА и 0,1 М трисбуфер, рН 7,5). Затем суспензию подвергают действию ультразвука. (22 кГц, 40JJ. А) в течение 25 мин. После этого центрифугируют в тепле (15-18 С) ЗО мин при 200000250000 д. Супернатант используют для дальнейшей очистки АТФазы. Осадок помещают в холодильник () для дальнейшего получения фермента, Общий белок 18,10 мг, общая активность 81,.00 мкМ фосфора/мин, удельная активность 4,50 мкМ фосфора/мг белкамин. Очистку АТФазы начинают с изоэлект рической преципитации, усупернатанта доводят рН до 5,4 уксусной кислотой (1 н). Раствор сразу же центрифугируют 3-5 мин при 18000 g, . осадок выбрасывают. У супернатанта доводят рН. до 6,8-7 сухим трисом (время экспозиции рН 5,4 не больше 10 мин). Общий.белок 4,31мг, общая активность 23,26 мкМ фосфора/мг белка, мин, удельная активность 4,7 мкМ фосфора/мг белка-мин. К раствору фермента добавляют сульфат аммония до конечной концентраци 1 50% от- на.сыщения, корректируя при этом рН 7,0-7,5 трисом. Раствор выдерживают 30 мин при температуре 4С, затем центрифугируют 10 мин при 10000 д. Супернатант выбрасывают, осадок растворяют в среде (0,25 М сахароза, 0,001 М ЭДТА, 0,03 М АТФ и 0,001 М трис-буфер, рН 7,5) до концентрации 0,5 мг белка/мл. Раствор помещают в баню с температурой , нагревают до 64°С и быстро переносят в баню с температурой , где выдерживают в течение 4 мин. Общий белок 2,48 мг, общая, активность 39,92.мкМ.фосфора/мин, удельная активность 16,12 мкМ фосфора/мг белка- мин. К супернатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 50% от насыщения, корректируя рН 7,0-7,5 трисом. Общая активность фермента 31,45 мкМ фосфора/мин, удельная активность 16,01 мкМ фосфора/мг белкаМИН, общий белок 1,92 мг, Полученный белок обладает АТФаэной активностью, устойчив к олигомицину и ингибируется ЦМКД. Примерз (максимальные значения параметров) . Получают из голов-. ного мозга митохондрии, например, по методу Фонье и Шомодьи. Общий бе

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРИМОЙ Н -АТФАЗЫ путем освобождения митохондрий от внешних мембран в гипотонической среде,воздействия ультразвуком, экстрагирования и очистки целевого продукта высаливанием сульфатом аммоиия,о тличающийся. тем, что, с целью получения раство- , римой Н -АТФазы с большей удельной активностью, клетки головного мозга :очищают от миелина и синаптосом в градиенте плотности сахарозы 0,7 1,2 и 1,5 М, обрабатывают хлороформом и ультразвуком двукратно по 4т6 мин и затем однократно в течение 23-27 мин, а перед высаливанием сульфатом аммония проводят йзоэлектрическую преципитацию, далее пробу инкубируют при 64С, а це левой продукт повторно высаливают сульфатом аммония.